兔抗Myc標簽抗體親和純化，通用檢測工具，加速蛋白表達與互作研究

本文提供由艾美捷Bethyl Laboratories推出的識別c-Myc表位標簽（氨基酸序列EQKLISEEDL）的兔源多克隆抗體（貨號：A190-105A）的完整技術參數與標準化操作流程。該抗體適用于Western Blot、免疫沉淀、免疫細胞化學及ELISA等多種檢測平臺，用于檢測N端或C端攜帶Myc標簽的重組蛋白表達。

一、產品基本特性

該抗體為兔多克隆抗體，以全IgG形式提供，未經標記。其特異性靶點為Myc標簽（人c-Myc蛋白第410–419位氨基酸，序列：EQKLISEEDL）。該標簽廣泛用于重組蛋白工程，可融合于目的蛋白的N端或C端。

抗體通過抗原親和純化獲得：將合成肽段（Myc序列與KLH偶聯）免疫兔子后，采用固相固定化的Myc肽段進行親和層析，特異性分離抗Myc抗體。該工藝確?？贵w僅識別Myc標簽序列，不與天然蛋白中的其他表位發生交叉反應。

抗體濃度標定為1 mg/ml（比爾定律，A280法）。高濃度便于靈活稀釋，適配多種應用需求。

二、儲存與緩沖體系

儲存條件：2 – 8°C冷藏，嚴禁冷凍。反復凍融會導致抗體變性聚合，降低效價。

有效期：收貨之日起1年。未開封且嚴格避光保存可維持完整活性。

緩沖液組成：磷酸鹽緩沖液（PBS），含0.09%疊氮鈉作為防腐抗菌劑。

注意事項：疊氮鈉會抑制HRP活性。若后續使用HRP標記二抗進行WB或ELISA，必須通過充分洗滌（3–5次，每次5分鐘）去除疊氮鈉殘留；或選用不含疊氮鈉的緩沖液。對于熒光檢測（ICC），疊氮鈉影響較小。

三、推薦應用與操作流程

以下稀釋度范圍為推薦起始條件，因不同重組蛋白的表達水平和融合標簽位置（N端/C端）可能影響抗體識別效率，用戶需進行滴定優化。

1. 酶聯免疫吸附測定 (ELISA)

直接包被或檢測：

包板濃度：1:100 – 1:500（如用于捕獲抗體包被，推薦1:200稀釋，約5 ?g/ml）

檢測稀釋度：1:1,000 – 1:30,000（作為一抗檢測包被的Myc標簽蛋白）

操作建議：

包被：將純化的Myc標簽蛋白或細胞裂解物（已知含Myc標簽）用碳酸鹽緩沖液（pH 9.6）稀釋，4°C過夜。

封閉：1% BSA或5%脫脂奶粉的PBS-T（0.05% Tween-20），室溫1小時。

一抗孵育：按1:1000–1:5000稀釋于封閉液中，室溫1–2小時。

洗滌：PBST洗滌3次。

二抗：HRP標記的山羊抗兔IgG (H+L)，按推薦稀釋度使用。

顯色：TMB底物，450 nm讀板。

2. 免疫細胞化學 (ICC)

稀釋范圍：1:100 – 1:400

樣本準備：瞬時或穩定轉染Myc標簽融合蛋白的細胞（如HeLa、293T），接種于蓋玻片或孔板。

操作流程：

1. 固定：4%多聚甲醛室溫10–15分鐘。

2. 透化：0.1% Triton X-100（或0.5% saponin）室溫10分鐘（視目標蛋白定位而定；膜蛋白檢測可省略透化）。

3. 封閉：3% BSA + 5%正常山羊血清，室溫30分鐘。

4. 一抗孵育：按1:100–1:400稀釋于封閉液中，4°C過夜。

5. 洗滌：PBS洗滌3次。

6. 熒光二抗孵育：使用Alexa Fluor標記的山羊抗兔IgG（1:500），避光室溫1小時。

7. 復染：DAPI染色細胞核。

8. 封片：抗熒光淬滅封片劑，共聚焦或熒光顯微鏡觀察。

陽性對照：表達已知Myc標簽蛋白的細胞；陰性對照：未轉染細胞或使用兔正常IgG替代一抗。

3. 免疫沉淀 (IP)

用量：1 – 4 ?g抗體 / mg總蛋白裂解物

推薦起始用量：對于高表達的重組蛋白（如過表達系統），使用1–2 ?g/mg；對于低表達的內源性水平（通常無內源性Myc標簽，除非敲入模型），使用4 ?g/mg。

操作步驟：

1. 裂解細胞：使用非變性IP裂解緩沖液（如50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP-40，含蛋白酶抑制劑）。

2. 預清除：裂解液與Protein A/G磁珠（或瓊脂糖珠）孵育30分鐘，去除非特異性結合。

3. 抗體結合：取澄清裂解液（1 mg總蛋白），加入1–4 ?g抗體，4°C旋轉孵育2–4小時或過夜。

4. 捕獲：加入20–30 ?l Protein A/G磁珠，繼續孵育1–2小時。

5. 洗滌：用裂解緩沖液洗滌磁珠3–5次。

6. 洗脫：加入2×SDS上樣緩沖液，95°C變性5分鐘，取上清進行WB分析。

注意事項：若后續WB檢測使用抗兔二抗，IP洗脫樣品中的抗體重鏈（~55 kDa）和輕鏈（~25 kDa）會被二抗識別，可能干擾目標蛋白（若其在55或25 kDa附近）。建議使用抗兔IgG輕鏈特異性HRP二抗進行WB檢測，或在封閉液中加入5%正常豬血清以減少干擾。

4. 蛋白質印跡 (WB)

稀釋范圍：1:1,000 – 1:30,000（極寬動態范圍，體現高靈敏度）

起始建議：從1:2,000開始。若信號過強（過表達系統），可稀釋至1:10,000–1:30,000；若信號弱（內源性或低表達），可提高至1:1,000。

封閉液：5%脫脂奶粉的TBST（含0.1% Tween-20）。

一抗孵育：4°C過夜（推薦）或室溫2小時。

膜與轉膜：常規PVDF或硝酸纖維素膜，標準濕轉或半干轉。

二抗：山羊抗兔IgG(H+L)-HRP（貨號A120-101P），稀釋度1:5,000–1:20,000。

IP后WB：若一抗為IP所用的兔抗Myc，WB檢測時應使用抗兔IgG輕鏈HRP二抗（避免重鏈干擾）。該二抗需在封閉緩沖液中加入5%正常豬血清（貨號S100-020）以降低背景。

顯色：化學發光（ECL）底物，曝光時間依信號強度調整。

預期條帶：目標蛋白分子量 = 目的蛋白 + Myc標簽（~1.2 kDa）。應在相應位置檢測到特異條帶。陰性對照（未轉染裂解液）無條帶。

四、注意事項與質量控制

應用驗證：說明書標注“Not all listed applications have been specifically tested by our laboratory”。雖然提供了各應用的稀釋范圍，但用戶需根據實際樣本自行優化。尤其ELISA包被濃度和ICC的固定/透化條件可能需要調整。

標簽位置影響：若Myc標簽融合在蛋白的N端，可能被部分蛋白酶切割；C端標簽更穩定但可能掩蓋某些功能域。檢出信號強弱與標簽暴露程度相關，若WB信號弱，可嘗試使用變性更強（如RIPA）的裂解液，使標簽充分暴露。

陽性對照：強烈建議使用已知表達的Myc標簽陽性裂解物（如商業化的Myc標簽蛋白或轉染Myc-空載體的細胞裂解液）作為WB陽性對照，以排除抗體失效或操作問題。

交叉反應性：該抗體針對合成肽段制備，不識別內源性人c-Myc蛋白（除非目的蛋白序列恰好包含該表位，但天然c-Myc往往被屏蔽）。因此，在未轉染的哺乳動物細胞裂解物中不應出現信號。若出現非預期條帶，可能是由于與其他蛋白的交叉反應（極罕見）或非特異性結合。

儲存穩定性：2–8°C可穩定保存1年。切勿冷凍。長期使用建議分裝（每管10–20 ?l）于微量離心管中，仍冷藏保存，避免反復開蓋導致污染或效價下降。