Life Diagnostics：奶牛乳鐵蛋白酶聯免疫吸附試驗標準品/樣品準備

乳鐵蛋白是一種非血紅素鐵結合糖蛋白，存在于牛奶、其他分泌液和血液中。作為宿主防御的一部分，它具有抗菌和抗炎活性。它是牛乳腺炎的生物標志物。1,2乳鐵蛋白水平從正常牛奶中的低于0.05mg/ml到乳腺炎動物牛奶中的高于8mg/ml不等。

該測定使用親和純化的奶牛乳鐵蛋白抗體進行固相（微量滴定孔）固定，使用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的奶牛乳鐵蛋白抗體進行檢測。將標準樣品和稀釋樣品在微量滴定孔中孵育45分鐘。隨后清洗這些井。加入HRP偶聯物并孵育45分鐘。這導致乳鐵蛋白小分子夾在固定抗體和檢測抗體之間。然后洗滌孔以去除未結合的HRP綴合物，加入TMB并孵育20分鐘。如果乳鐵蛋白存在，則會出現藍色。通過加入Stop溶液停止顯色，將顏色變為黃色，并在450nm處測量吸光度。乳鐵蛋白的濃度與吸光度成正比，由標準曲線得出。

艾美捷Life Diagnostics標準品準備：

乳鐵蛋白標準品為凍干形式。根據瓶簽上的指示加入蒸餾水或去離子水的體積，并輕輕混合直至溶解（如果打算將來使用，重新溶解的標準品應分裝并存放在-20°C或更低的溫度下）。

標記7個聚丙烯或玻璃試管為100、50、25、12.5、6.25、3.13和1.56 ng/ml。

在標記為100 ng/ml的試管中，根據標準品瓶簽上的詳細說明，用1x稀釋液稀釋重新溶解的標準品，準備100 ng/ml的標準品。

在標記為50、25、12.5、6.25、3.13和1.56 ng/ml的試管中分別加入250 ?l的1x稀釋液。

通過將標記為50 ng/ml的試管中的250 ?l 100 ng/ml標準品與250 ?l稀釋液混合稀釋，準備50 ng/ml的標準品。

類似地，通過兩倍連續稀釋準備其余的標準品。

樣品準備：

牛奶：為了獲得最佳結果，牛奶應處理成脫脂奶或乳清。脫脂奶可以通過在4°C下以>3000g離心牛奶15分鐘來獲得。乳清是通過用冰醋酸將脫脂奶調節至pH 4.5，然后離心并使用5M NaOH將上清液的pH調節回6.5 – 7.5來準備的。為了獲得在標準曲線范圍內的值，我們建議每個待測樣品使用以下程序進行10,000倍稀釋。

向兩個試管中分別加入495 ?l的1x稀釋液。

將5.0 ?l樣品吸入第一個試管并混合。這提供了100倍的稀釋。

將5.0 ?l的100倍稀釋樣品與第二個試管中的495 ?l稀釋液混合。這提供了10,000倍的稀釋。 血清：正常血清中的乳鐵蛋白水平大約為100 ng/ml。為了在檢測前避免基質效應，樣品必須稀釋20倍或更多。

結果計算：

使用曲線擬合軟件，通過將標準品的吸光度值與濃度的常用對數對數圖繪制標準曲線。

將標準曲線擬合到四參數邏輯回歸（4PL）方程（x軸=濃度的常用對數），并從標準曲線確定樣品的濃度（記得從反對數中得到濃度）。

將得出的濃度乘以稀釋因子，以確定血清或血漿樣品中的實際濃度。

如果樣品的A450值超出標準曲線范圍，應適當稀釋樣品并重新檢測。

參考文獻：

1. Kawai K, Hagiwara S, Anri A, Nagahata H. Lactoferrinconcentration in milk of cow clinical mastitis. Vet Res Commun.23(7):391-398 (1999)

2. Harmon RJ et’al. Changes in lactoferrin, immunoglobulin G, cowserum albumin, and a-lactalbumin during acute experimentaland natural coliform mastitis in cows. Infection and Immunity.13:533-542 (1976)

Life Diagnostics 專注于研發和生產臨床前研究以及動物醫學診斷相關的ELISA試劑盒、純化的生物標志物和抗體等產品。產品覆蓋心血管疾病、急性期反應、免疫毒性和免疫學標志物等研究領域，主要應用于小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、猴和雞等物種。艾美捷科技是Life Diagnostics的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。