Life Diagnostics：駱駝血清淀粉樣蛋白A酶聯免疫吸附試驗檢測原理

血清淀粉樣蛋白A（SAA）是一種≈12kD的陽性急性期蛋白，以杠桿形式表達并在血液中循環。它是包括駱駝科在內的許多物種炎癥和疾病的有用生物標志物。1該檢測方法可識別駱駝和羊駝血清中的SAA。與駱駝SAA的反應性尚未得到調查。

該檢測使用兩種不同的肽特異性駱駝SAA抗體；一種用于固相固定（微量滴定孔），另一種與辣根過氧化物酶（HRP）結合用于檢測。將標準品和稀釋樣品與HRP綴合物一起在微量滴定孔中孵育一小時。這導致SAA分子夾在固定抗體和檢測抗體之間。然后洗滌孔以去除未結合的HRP綴合物。加入TMB并孵育20分鐘。如果SAA存在，則會出現藍色。通過添加Stop溶液停止顯色，將顏色變為黃色，并在450nm處測量吸光度。SAA的濃度與吸光度成正比，由標準曲線得出。

艾美捷Life Diagnostics試劑盒提供的材料：

包被血清淀粉樣蛋白A（SAA）抗體的96孔板（12條8孔條）

辣根過氧化物酶（HRP）結合物，11毫升

血清淀粉樣蛋白A（SAA）標準品（凍干）

20倍洗滌液；TBS50-20，50毫升

稀釋液；CSD50-1，50毫升

四甲基聯苯胺（TMB），TMB11-1，11毫升

終止液，SS11-1，11毫升

未提供但必需的材料：

移液器和吸頭

蒸餾水或去離子水

聚丙烯或玻璃試管

渦旋混合器

水浴

吸水紙或紙巾

板式孵育器/振蕩器

板式洗板機

能夠測量450納米吸光度的板式閱讀器

曲線擬合軟件

保存：

SAA庫存應儲存在-20℃或以下。試劑盒的剩余部分應儲存在2-8°C的溫度下，微量滴定板應保存在帶干燥劑的密封袋中。套件自購買之日起六個月內保持穩定。

標準品準備：

按照瓶簽上的說明重新溶解血清淀粉樣蛋白A（SAA）標準品。使用前輕輕混合數次。標準品不需要加熱處理。

標記7個聚丙烯試管為500、250、125、62.5、31.25、15.63和7.81 ng/ml。

在標記為500 ng/ml的試管中，根據SAA標準品瓶簽上詳細說明的量取適量的稀釋液。然后加入指示體積的標準品并輕輕混合。這便提供了500 ng/ml的標準品。

在標記為250、125、62.5、31.25、15.63和7.81 ng/ml的試管中分別加入250 ?l的稀釋液。

將250 ?l的500 ng/ml SAA標準品吸入標記為250 ng/ml的試管并混合。這便提供了250 ng/ml的SAA標準品。

類似地，通過兩倍連續稀釋準備其余的標準品。如果不打算立即使用剩余的標準品，應將其冷凍存儲在-20°C或更低的溫度下。

樣品準備：

Life Diagnostics的研究表明，駱駝血清至少應稀釋4倍。除非稀釋50倍或更多，否則不應使用血漿。最佳稀釋比例應由研究者確定。

檢測程序：

將所需數量的8孔條固定在支架中。未使用的條應存放在重新密封的袋子里，并與干燥劑一起存放在2-8°C下以備將來使用。

向孔中加入100 ?l的標準品和樣品（我們建議標準品和樣品運行兩次）。

向每個孔中加入100 ?l的HRP結合物。

在25°C下，以150轉/分鐘的速率在板式振蕩器上孵育一小時。

使用板式洗板機（每孔400 ?l）用1x洗滌液洗孔5次。

將孔猛擊在吸水紙或紙巾上以去除所有殘留的液滴。

向每個孔中加入100 ?l的TMB。

在25°C下，以150轉/分鐘的速率在軌道式微孔板振蕩器上孵育20分鐘。

20分鐘后，向每個孔中加入100 ?l的終止液以停止反應。

輕輕混合。確保所有藍色變為黃色非常重要。

在5分鐘內，使用板式閱讀器讀取450 nm處的吸光度。

典型標準曲線：

下圖展示了一個典型的標準曲線，以450納米處的吸光度作為Y軸，相對于X軸上的血清淀粉樣蛋白A（SAA）濃度。這個曲線僅用于說明。

參考文獻：

1. El-Deeb WM, Fouda TA and El-Bahr SM. Clinico-biochemicalinvestigation of paratuberculosis of dromedary camels in SaudiArabia: Proinflammatory cytokines, acute phase proteins andoxidative stress biomarkers. http://www.pvj.com.pk/in_press/13-534.pdf (2014)

Life Diagnostics 專注于研發和生產臨床前研究以及動物醫學診斷相關的ELISA試劑盒、純化的生物標志物和抗體等產品。產品覆蓋心血管疾病、急性期反應、免疫毒性和免疫學標志物等研究領域，主要應用于小鼠、大鼠、兔、貓、狗、豬、猴和雞等物種。艾美捷科技是Life Diagnostics的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。