BPS Bioscience GCGR/CRE 熒光素酶報告基因 HEK293 細胞系解決方案

GCGR/CRE熒光素酶報告基因HEK293細胞系是一種HEK293細胞系，表達由cAMP反應元件（CRE）控制的螢火蟲熒光素酶，以及人類GCGR（胰高血糖素受體；NM_000160.5）?？梢酝ㄟ^測量熒光素酶活性來監測這些細胞中GCGR的激活。該細胞系已使用胰高血糖素和Retatrutide激動劑進行了功能性驗證。

圖1. GCGR/CRE熒光素酶報告基因HEK293細胞系用胰高血糖素處理時的作用機制示例。

胰高血糖素與GCGR結合，觸發腺苷酸環化酶的激活，導致細胞內cAMP增加。蛋白激酶A被激活，允許CRE啟動子的激活和熒光素酶的產生。因此，熒光素酶活性與GCGR與其激動劑的結合成正比。

背景

胰高血糖素受體（GCGR）屬于B1類G蛋白偶聯受體（GPCR家族）。與GLP-1R（胰高血糖素樣肽1受體）和GIPR（胃抑制多肽受體）一起，它是調節葡萄糖穩態的關鍵受體之一。GCGR的配體胰高血糖素通過GCGR和GLP-1R在胰島β細胞中增加胰島素分泌，盡管GLP-1R是主要的胰島素促進受體。此外，已經顯示胰高血糖素增強嚙齒動物和人類的肝臟脂質代謝并減少食物攝入。最近，三激素受體激動劑Retatrutide和幾種GLP1R/GCGR雙重激動劑的臨床結果令人鼓舞，表明GCGR可能是治療2型糖尿病和肥胖癥的一個有前景的共同刺激靶標。

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應用

在細胞模型中篩選人類GCGR的激動劑

細胞解凍

1. 從液氮儲存中取出一個細胞小瓶。在準備解凍前保持在干冰上。

2. 準備解凍時，在37°C水浴中搖晃裝有冷凍細胞的小瓶大約60秒。一旦細胞解凍（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部內容轉移到一個空的50毫升錐形管中。

注意：在37°C的水浴中放置細胞過久會導致活性迅速喪失。

3. 使用10毫升的血清學移液管，緩慢地向含有細胞的錐形管中加入10毫升預溫的解凍培養基1。解凍培養基1應滴加同時輕輕搖晃錐形管，以實現溫和混合并避免滲透沖擊。

4. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基并用5毫升預溫的解凍培養基1重懸細胞。

5. 將重懸的細胞轉移到T25培養瓶中，并在37°C和5% CO2培養箱中培養。

6. 培養24小時后，檢查細胞附著和活性。更換培養基為新鮮的解凍培養基1，并繼續在37°C和5% CO2培養箱中培養，直到細胞準備好分裂。

7. 細胞應在完全融合前進行傳代。在第一次傳代和后續傳代中，使用生長培養基1G。

細胞傳代

1. 抽吸培養基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05%胰酶/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基1A并轉移到試管中。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基并用生長培養基1G重懸細胞。

4. 按照推薦的1:6至1:8的傳代比例，每周一次或兩次將細胞種植到新的培養容器中。

細胞冷凍

1. 抽吸培養基，用無Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細胞，并用0.05%胰酶/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基1G并計數細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基并在4°C的細胞冷凍培養基（BPS Bioscience #79796）中重懸細胞，細胞濃度約為2 x 10^6個細胞/毫升。

4. 將1毫升的細胞懸浮液分裝到每個冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

5. 次日將小瓶轉移到液氮中長期保存。

注意：建議在早期傳代時擴增細胞并至少冷凍10個小瓶以備將來使用。

圖2. GCGR/CRE熒光素酶報告基因HEK293細胞系對GCGR激動劑胰高血糖素和Retatrutide的劑量反應曲線。

細胞用逐漸增加濃度的胰高血糖素（上圖）和Retatrutide（下圖）處理。使用ONE-Step?熒光素酶檢測系統測量發光。

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Products Catalog # Size

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