BPS Bioscience 腺苷A2A受體功能HEK293細胞系的免疫檢查點功能與潛在治療應用

腺苷A2A受體（A2aR或ADORA2A）在HEK293細胞中穩定表達（NM_000675.5）。A2aR是七跨膜G蛋白偶聯受體（GPCR）家族的成員。A2aR的活動通過Gαs蛋白介導，該蛋白激活腺苷酸環化酶，導致細胞內cAMP的合成。cAMP的水平與腺苷的水平相關。這個細胞系可以用來測量A2aR激動劑或拮抗劑的EC50和IC50值。

腺苷信號在炎癥和免疫反應中扮演著重要角色。腫瘤微環境中的許多細胞表達異位的CD39和CD73，導致細胞外腺苷的積累。腺苷與T細胞、巨噬細胞、NK細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞表面的高親和力腺苷A2A受體（A2aR）結合，導致免疫反應的下調。因此，A2aR是一種新型的免疫檢查點蛋白，A2aR的阻斷正在作為潛在的免疫療法被積極研究。幾種A2aR拮抗劑已經進入帕金森病治療的臨床試驗，并且前臨床研究已經證實阻斷A2aR激活能夠顯著增強抗腫瘤免疫。用A2aR拮抗劑（如ZM241385或咖啡因）處理的小鼠顯示出明顯的腫瘤生長延遲，而A2aR敲除小鼠顯示出增加的腫瘤排斥。最有希望的是，A2aR阻斷可以與其他免疫檢查點途徑的抑制協同使用。研究表明，A2aR阻斷和PD-1抑制的聯合使用比單獨任一治療更有效，A2aR阻斷增加了CTLA-4和TIM-3抑制在控制CD73+黑色素瘤生長中的活性。

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應用

? 篩選或滴定A2aR的激動劑或拮抗劑。

? 研究PD-1和CTLA-4聯合療法。

細胞培養協議

細胞解凍

1. 在37°C水浴中搖晃冷凍細胞的小瓶大約60秒。細胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將整個小瓶內容物轉移到含有10毫升預溫的解凍培養基1（不含潮霉素）的試管中。在37°C水浴中放置過久會導致細胞活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在5毫升預溫的解凍培養基1（不含潮霉素）中重懸細胞。

3. 將重懸的細胞轉移到T25或T75培養瓶中，并在37°C的5% CO2培養箱中培養。

4. 培養24小時后，檢查細胞附著和活性。更換為新鮮的解凍培養基1（不含潮霉素），并在37°C的5% CO2培養箱中繼續培養，直到細胞準備好傳代。

5. 細胞應在完全融合前傳代。在第一次傳代及后續傳代中，使用生長培養基1G（含潮霉素）。

細胞傳代

1. 抽吸培養基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基1G并轉移到試管中。以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在生長培養基1G（含潮霉素）中重懸細胞。按照期望的次培養比例[每周1:6至1:8或每周兩次]接種到新的培養容器中。

細胞冷凍

1. 抽吸培養基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基1G并計數細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在4°C的冷凍培養基（BPS Bioscience #79796，或10% DMSO + 90% FBS）中重懸細胞至約2 x 10^6細胞/毫升。

4. 將1毫升的細胞等分到冷凍小瓶中。將小瓶放置在保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

5. 次日將小瓶轉移到液氮中保存。

數據展示：

圖1：在HEK293細胞表面表達人類A2aR。

細胞與PE標記的抗人A2aR抗體（R&D Systems #FAB94971P100）共同孵育，并通過流式細胞儀進行分析。親本HEK293細胞用作陰性對照（紅色）。

檢測到一個A2aR陽性的克隆群體（克隆B11）（藍色）。

文獻參考：

1. Leone RD, et al. (2015) Comp. Struct. Biotechnol. J. 13: 265-272

2. Ma S-R, et al. (2017) Molec. Cancer 16: 99

3. Ohta A, et al. (2016) Front. Immunol. 7: 109.

4. Yang et al, et al. (2017) Purinergic Signal. 13(2): 191–201

5. Mediavilla-Varela, et al. (2017) Neoplasia. 19(7) : 530–536 

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認證的生命科學領域的供應商，公司一直致力于開發藥物研發領域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創立，從創立至今一直致力于提供藥物研發領域的創新解決方案，以推動新的藥物發現。公司主要關注的領域包括免疫療法、表觀遺傳學、新型冠狀病毒、CRISPR、細胞信號轉導等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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