人BRG1/SMARCA4兔多克隆抗體，精準COPII囊泡運輸分析工具

一、產品概述

本文介紹一款由艾美捷Bethyl Laboratories推出的針對人BRG1/SMARCA4的兔多克隆抗體（貨號：A300-813A）。該抗體特異性識別BRG1蛋白第75–125位氨基酸之間的N端區域，經抗原親和純化后以完整IgG形式提供，未偶聯標記物。已驗證反應種屬為人及小鼠，推薦應用于免疫組織化學（IHC）、免疫沉淀（IP）及免疫印跡（WB）。

BRG1（亦稱為SMARCA4）是哺乳動物SWI/SNF染色質重塑復合物（BAF復合物）的核心ATP酶亞基。該復合物通過水解ATP改變核小體位置，調控基因轉錄。BRG1與BRCA1相互作用，參與DNA損傷修復及轉錄調控。BRG1基因突變與多種癌癥（如非小細胞肺癌、卵巢癌、神經發育障礙相關）。可靠的特異性抗體對于研究染色質動態調控及腫瘤發生機制具有重要意義。

二、詳細規格參數

參數 | 信息

靶標 | BRG1/SMARCA4

反應種屬 | 小鼠、人

應用 | IHC, IP, WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 完整IgG

免疫原 | 第75–125位氨基酸之間的區域

亞型 | IgG

偶聯物 | 未偶聯

純度 | 抗原親和純化

免疫原種屬 | 人

濃度 | 200 ?g/ml

存儲條件 | 2–8 °C

有效期 | 收貨后1年

緩沖液 | Tris緩沖鹽水，含0.1% BSA及0.09%疊氮化鈉

濃度說明：本產品濃度為200 ?g/ml，不同于常規1000 ?g/ml產品。使用時需根據此濃度換算抗體體積（例如IP用6 ?g對應30 ?l）。

三、抗原表位與生產信息

該抗體識別的人BRG1/SMARCA4表位位于第75–125殘基之間的N端區域，參考序列號為NP_003063.2（GeneID 6597）。免疫原對應此N端區段。

選擇N端區域作為免疫原的策略具有明確優勢：BRG1/SMARCA4的C端包含解旋酶結構域和ATP結合位點，相對保守；而N端75–125區段在BRG1與高度同源的BRM（SMARCA2）之間差異較大，有助于特異性識別BRG1而非BRM，減少交叉反應。

純化工藝采用固相載體固定的表位特異性親和層析，僅富集針對該N端表位的高親和力IgG分子。緩沖液中含有0.1% BSA作為載體蛋白，有助于低濃度（200 ?g/ml）下抗體的穩定性，減少管壁吸附。

免疫球蛋白濃度通過比爾定律測定（1 mg/mL IgG在A280處的吸光度為1.4）。

四、應用方法與推薦條件

4.1 免疫印跡（WB）

推薦稀釋比：1:2,000 至 1:10,000

通用條件：

封閉液及抗體稀釋液：含5%脫脂牛奶的TBST

一抗孵育：4°C過夜

細胞裂解液WB二抗：山羊抗兔IgG（重鏈+輕鏈）HRP抗體（貨號A120-101P）

免疫沉淀產物WB二抗：抗兔IgG輕鏈HRP偶聯抗體，封閉緩沖液中需添加5%正常豬血清（S100-020）

樣品制備建議：

BRG1分子量約180–200 kDa（預測約180 kDa，實際因磷酸化修飾可能遷移略高）。

使用人或小鼠細胞裂解液（如HeLa、HEK293T、NIH/3T3）作為陽性對照。BRG1普遍表達，尤其在上皮細胞中豐度較高。

推薦上樣量：20–40 ?g總蛋白/泳道。

裂解液需包含蛋白酶抑制劑，因BRG1可能被內源性蛋白酶降解。

凝膠與轉膜：

建議使用6–8% SDS-PAGE或4–12%梯度凝膠分離BRG1（180 kDa）。

轉膜使用PVDF膜（0.45 ?m孔徑），濕轉條件：250 mA，2.5–3小時，或4°C過夜轉膜（30 V）?？商砑?.01% SDS至轉膜緩沖液以提升大蛋白轉膜效率。

曝光：BRG1表達豐度中等，ECL曝光時間通常為1–10分鐘。

4.2 免疫組織化學（IHC）

推薦稀釋比：1:500 至 1:2,000

抗原修復：推薦使用檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0） 進行熱誘導表位修復（HIER）。微波加熱至95–100°C，持續10–15分鐘。

樣本類型：福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）的人或小鼠組織切片。

檢測步驟建議：

1. 脫蠟水化后，使用3%過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶。

2. 抗原修復后，以5%正常山羊血清或BSA封閉30–60分鐘。

3. 一抗4°C孵育過夜（推薦1:1,000起始稀釋）。

4. 使用HRP標記的二抗及DAB顯色系統檢測。

對照設置：

陽性對照：人正常睪丸組織（已知BRG1高表達于生精細胞）或多種腫瘤組織。

陰性對照：使用同型IgG或未免疫兔血清替代一抗；或使用BRG1敲除細胞系制作組織芯片。

4.3 免疫沉淀（IP）

推薦用量：6 ?g 抗體 / mg 蛋白裂解液

重要體積換算：本抗體濃度為200 ?g/ml，因此6 ?g對應 30 ?l 抗體體積（而非通常的6 ?l）。務必根據實際濃度計算。

操作流程如下：

1. 細胞裂解：使用非變性裂解緩沖液（如含0.5% NP-40、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 7.4，添加蛋白酶抑制劑）。避免SDS以免破壞染色質復合物。

2. 預清除：取300–500 ?g總蛋白裂解液，與1 ?g同型兔IgG及20 ?l蛋白A/G瓊脂糖珠孵育1小時。

3. 免疫沉淀：預清除上清中加入30 ?l A300-813A抗體（6 ?g），4°C旋轉孵育過夜。

4. 捕獲：加入30 ?l蛋白A/G珠，繼續孵育2小時。

5. 洗滌：使用裂解緩沖液洗滌4次，最后一次可用高鹽緩沖液（300 mM NaCl）洗滌以降低背景。

6. 洗脫：加入30 ?l 2× SDS上樣緩沖液（添加DTT），煮沸5–10分鐘，離心后取上清進行WB檢測。

IP產物WB檢測注意事項：必須使用抗兔IgG輕鏈HRP抗體，并添加5%正常豬血清封閉，以避免重鏈（55 kDa）干擾BRG1（180 kDa）的檢測。由于目標條帶遠高于重鏈，實際干擾風險較低，但輕鏈二抗仍是最佳實踐，可徹底排除重鏈信號。

五、儲存與穩定性

未稀釋抗體必須儲存于2–8°C，嚴禁冷凍。冷凍會導致BSA和IgG的共聚集及活性喪失。在推薦條件下，自收貨之日起可穩定保存1年。

緩沖液中含有0.09%疊氮化鈉作為防腐劑，0.1% BSA作為穩定劑。BSA可減少抗體對管壁的非特異性吸附，尤其適合低濃度抗體（200 ?g/ml）的長期保存。若IP產物后續擬用于質譜分析，需通過脫鹽柱去除疊氮化鈉和BSA。分裝建議：無需分裝，使用原瓶并注意無菌操作即可。