兔抗KIAA0310抗體親和純化，高分子量蛋白檢測專用解決方案

一、產品概述

本文介紹一款由艾美捷Bethyl Laboratories推出的針對人KIAA0310（即SEC16A）的兔多克隆抗體（貨號：A300-648A）。該抗體特異性識別KIAA0310蛋白第775–825位氨基酸之間的區域（表位實際映射至第600–650位），經抗原親和純化后以完整IgG形式提供，未偶聯標記物。已驗證反應種屬為人，推薦應用于免疫沉淀（IP）及免疫印跡（WB）。

KIAA0310是在Kazusa cDNA測序項目中通過生物信息學預測的假設蛋白，后續研究證實其為人類SEC16A同源物。在芽殖酵母中，Sec16是定位于內質網膜的蛋白，通過與COPII囊泡包被復合物相互作用參與蛋白質從內質網向高爾基體的運輸。SEC16A在哺乳動物細胞中同樣作為內質網輸出位點（ERES）的組織者，對COPII介導的分泌通路至關重要?？煽康奶禺愋钥贵w對于研究分泌途徑、內質網應激響應及囊泡運輸調控具有重要價值。

二、詳細規格參數

參數 | 信息

靶標 | KIAA0310（SEC16A）

反應種屬 | 人

應用 | IP, WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 完整IgG

免疫原 | 第775–825位氨基酸之間的區域

亞型 | IgG

偶聯物 | 未偶聯

純度 | 抗原親和純化

免疫原種屬 | 人

濃度 | 200 ?g/ml

存儲條件 | 2–8 °C

有效期 | 收貨后1年

緩沖液 | Tris緩沖鹽水，含0.1% BSA及0.09%疊氮化鈉

濃度說明：本產品濃度為200 ?g/ml，不同于常規1000 ?g/ml產品。使用時需根據此濃度換算抗體體積。

三、抗原表位與生產信息

該抗體識別的人KIAA0310表位位于第600–650殘基之間（參考序列號O15027，GeneID 9919）。免疫原設計對應第775–825區域，但親和純化及驗證所用表位為第600–650區間。這一差異不影響產品性能，用戶可依據已確認的表位區域（600–650）進行實驗設計。

純化工藝采用固相載體固定的表位特異性親和層析，僅富集針對該區域的高親和力IgG分子。緩沖液中含有0.1% BSA作為載體蛋白，有助于低濃度（200 ?g/ml）下抗體的穩定性，減少管壁吸附。

免疫球蛋白濃度通過比爾定律測定（1 mg/mL IgG在A280處的吸光度為1.4）。

四、應用方法與推薦條件

4.1 免疫印跡（WB）

推薦稀釋比：1:2,000 至 1:10,000

通用條件：

封閉液及抗體稀釋液：含5%脫脂牛奶的TBST

一抗孵育：4°C過夜

細胞裂解液WB二抗：山羊抗兔IgG（重鏈+輕鏈）HRP抗體（貨號A120-101P）

免疫沉淀產物WB二抗：抗兔IgG輕鏈HRP偶聯抗體，封閉緩沖液中需添加5%正常豬血清（S100-020）

凝膠推薦：3-8% Tris-乙酸酯凝膠

SEC16A分子量較大：預測分子量約250 kDa（實際因可變剪接可能為240–270 kDa）。使用低百分比Tris-乙酸酯凝膠可顯著改善高分子量蛋白的分離效果。

樣品制備建議：

使用人細胞裂解液（如HeLa、HEK293T、U2OS）作為陽性對照。SEC16A在多種細胞系中均有表達，但豐度較低，建議上樣40–60 ?g總蛋白。

裂解液需包含蛋白酶抑制劑，因SEC16A可能被內源性蛋白酶降解。

上樣前建議煮沸5分鐘，但過度煮沸可能導致高分子量蛋白聚集，可嘗試70°C加熱10分鐘作為替代。

4.2 免疫沉淀（IP）

推薦用量：6 ?g 抗體 / mg 蛋白裂解液

重要體積換算：本抗體濃度為200 ?g/ml，因此6 ?g對應 30 ?l 抗體體積（而非通常的6 ?l）。務必根據實際濃度計算。

操作流程如下：

1. 細胞裂解：推薦使用溫和裂解緩沖液（如含0.5% NP-40、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 7.4，添加蛋白酶抑制劑）。避免使用SDS，因其會破壞COPII復合物的相互作用。

2. 預清除：每個IP樣本使用300–500 ?g總蛋白，與1 ?g同型兔IgG及20 ?l蛋白A/G瓊脂糖珠孵育1小時。

3. 免疫沉淀：預清除上清中加入30 ?l A300-648A抗體（6 ?g），4°C旋轉孵育過夜。

4. 捕獲：加入30 ?l蛋白A/G珠，繼續孵育2小時。

5. 洗滌：使用裂解緩沖液洗滌4次，每次5分鐘；最后用高鹽緩沖液（含300 mM NaCl）洗滌1次以降低非特異性背景。

6. 洗脫：加入30 ?l 2× SDS上樣緩沖液（添加DTT），煮沸10分鐘，離心后取上清進行WB檢測。

IP產物WB檢測注意事項：必須使用抗兔IgG輕鏈HRP抗體，并添加5%正常豬血清封閉，以避免重鏈（55 kDa）干擾SEC16A（250 kDa）的檢測。由于目標條帶遠高于重鏈，實際上干擾風險較低，但輕鏈二抗仍是最佳實踐。

4.3 關于WB稀釋比的優化建議

由于SEC16A表達豐度相對較低且分子量大，建議從1:2,000開始試探，若背景過低可提高至1:5,000或1:10,000。若信號弱，可降低稀釋比至1:1,000。初次實驗時設置陽性對照（如HeLa裂解液）和陰性對照（如同型IgG IP）以確認抗體特異性。

五、儲存與穩定性

未稀釋抗體必須儲存于2–8°C，嚴禁冷凍。冷凍會導致BSA和IgG的共聚集及活性喪失。在推薦條件下，自收貨之日起可穩定保存1年。

緩沖液中含有0.09%疊氮化鈉作為防腐劑，0.1% BSA作為穩定劑。BSA可減少抗體對管壁的非特異性吸附，尤其適合低濃度抗體（200 ?g/ml）的長期保存。若IP產物后續擬用于質譜分析，需通過脫鹽柱去除疊氮化鈉和BSA。分裝建議：無需分裝，使用原瓶并注意無菌操作即可。