兔抗RAP80抗體親和純化，靈敏檢測內源性RAP80表達

一、產品概述

RAP80（受體相關蛋白80，又稱UIMC1）是一種核蛋白，最早被鑒定為與視黃酸相關睪丸受體（RTR）相互作用并抑制其與共抑制因子N-CoR的結合。后續研究表明，RAP80還能與雌激素受體α（ER-α）相互作用，通過其泛素相互作用基序（UIM）調控ER-α的轉錄活性。更重要的是，RAP80的UIM在BRCA1依賴性DNA損傷修復應答中發揮關鍵作用。本文介紹一款由艾美捷Bethyl Laboratories推出的針對人RAP80蛋白中部區域（第600至650位氨基酸）的兔多克隆抗體（貨號：A300-763A）。該抗體經抗原親和純化，以未標記完整IgG形式提供，濃度1000 ?g/ml，適用于免疫沉淀（IP）和蛋白質印跡（WB）檢測，反應性為人源樣本。

二、核心規格參數

參數 | 詳細信息

靶標 | RAP80 / UIMC1

反應性 | 人

應用 | IP， WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 完整IgG

免疫原 | 第600至650位氨基酸

亞型 | IgG

標記 | 未偶聯

純度 | 抗原親和純化

抗原物種 | 人

濃度 | 1000 ?g/ml

儲存溫度 | 2 – 8 °C

有效期 | 自收貨之日起1年

緩沖液 | Tris-檸檬酸/磷酸鹽緩沖液，pH 7-8，含0.09%疊氮化鈉

三、免疫原與表位定位

本抗體的免疫原對應人RAP80蛋白（UniProt ID: Q96RL1）第600至650位氨基酸之間的區域。參考序列登錄號為NP_057374.3，對應GeneID 51720（基因符號UIMC1）。該區域位于RAP80的C端部分，介于兩個泛素相互作用基序（UIM）與C端結構域之間。選擇這一表位有助于特異識別全長RAP80，同時避免與含有UIM的其他蛋白（如其他泛素結合蛋白）發生交叉反應。

四、生產與親和純化工藝

抗體采用固相載體上固定的RAP80特異性表位（第600-650位）進行親和純化。將該合成肽段偶聯至親和基質，兔抗血清經親和柱層析后獲得高純度、高特異性的多克隆抗體。免疫球蛋白濃度依據比爾定律測定：1 mg/ml IgG在280 nm波長處的吸光度為1.4。純化后抗體濃度為1000 ?g/ml，保存在Tris-檸檬酸/磷酸鹽緩沖液（pH 7-8）中，并添加0.09%疊氮化鈉作為防腐劑。

五、儲存與穩定性

抗體應在2°C至8°C條件下儲存，切勿冷凍。自收貨之日起，在推薦的儲存條件下有效期為1年。緩沖液中的疊氮化鈉會抑制過氧化物酶活性，若后續實驗需進行HRP標記（如直接標記本抗體），需通過透析或脫鹽去除疊氮化鈉。對于常規WB和IP實驗（本抗體作為一抗，配合二抗使用），一般無需處理。

六、應用指南與優化參數

以下稀釋度和操作條件基于產品驗證數據提供。所有蛋白質印跡實驗均使用含5%脫脂奶粉的TBST作為封閉液及抗體稀釋液，一抗孵育條件為4°C過夜。對于不同實驗類型，需根據樣本性質選擇適當的二抗。

免疫沉淀（IP）

推薦用量：6 ?g 抗體 / mg 細胞裂解物總蛋白

操作流程要點：

1. 制備細胞裂解液：推薦使用非變性裂解緩沖液（如含蛋白酶抑制劑的NP-40裂解液或RIPA緩沖液）。RIPA可能破壞某些蛋白相互作用，若需保留RAP80與BRCA1或其他修復蛋白的復合物，建議使用溫和裂解液（如20 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM EDTA）。

2. 取1 mg總蛋白裂解液，加入6 ?g本抗體。

3. 4°C旋轉孵育過夜，確?？乖?抗體充分結合。

4. 加入蛋白A瓊脂糖或磁珠（根據抗體宿主選擇兔特異性介質），繼續孵育2-4小時。

5. 用裂解液洗滌沉淀復合物3-5次。

6. 加入SDS-PAGE上樣緩沖液（含還原劑），煮沸5分鐘洗脫。

7. Western blot檢測：洗脫產物進行WB時，必須使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯抗體（而非識別重鏈的二抗），并在封閉緩沖液中添加5%正常豬血清（貨號S100-020），以避免免疫沉淀中抗體重鏈（約55 kDa）與RAP80（約80 kDa）信號重疊。

蛋白質印跡（WB）

推薦稀釋度：1:1,000 – 1:10,000

通用操作條件：

封閉液及抗體稀釋液：5%脫脂奶粉-TBST（含0.1% Tween-20的TBS）。

一抗孵育：4°C過夜（推薦）。

二抗使用：

細胞裂解液WB：使用常規山羊抗兔IgG（識別重鏈和輕鏈，貨號A120-101P）。

免疫沉淀后WB：必須使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯抗體，并在封閉液中添加5%正常豬血清（見上文IP部分）。

檢測：ECL化學發光檢測。

蛋白大?。篟AP80的表觀分子量約為80 kDa。建議同時上樣陽性對照裂解液（如HeLa、293T、MCF-7細胞裂解液）以及預染分子量標記。在還原條件下，RAP80遷移速度接近80 kDa標記。

注意：由于RAP80參與DNA損傷應答，使用DNA損傷劑（如喜樹堿、依托泊苷、電離輻射）處理細胞后，RAP80會被招募到DNA損傷位點，但其總蛋白水平通常不變。WB檢測時需注意樣本處理的一致性。