兔抗MAD2抗體親和純化，助力基因組穩定性與癌癥機制解析

產品概述

MAD2（有絲分裂阻滯缺陷蛋白2）是紡錘體組裝檢查點（spindle assembly checkpoint, SAC）的核心組分，確保在所有染色體正確排列到赤道板之前不啟動后期，從而維持基因組穩定性。本文介紹的由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗MAD2抗體親和純化（貨號：A300-300A）是一款兔源多克隆抗體，特異性識別MAD2蛋白，適用于免疫組織化學（IHC）和免疫沉淀（IP）應用，反應種屬為人。

基本規格

抗體類型：兔多克隆IgG，完整IgG形式，未偶聯。

免疫原：對應人MAD2蛋白第100至150位氨基酸殘基區間，參考SwissProt條目Q13257（GeneID 4085）。

純化方式：抗原親和純化——將特異性表位固定于固相載體，富集高特異性抗體。

濃度：1000 ?g/ml（測定方法：比爾定律，1 mg/mL IgG在A280nm處吸光度為1.4）。

緩沖體系：Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液，pH 7-8，含0.09%疊氮化鈉作為防腐劑。

儲存與穩定性：2-8°C保存，自收貨之日起穩定期1年。

反應種屬與特異性

已驗證反應種屬：人（Human）?？贵w識別表位位于MAD2蛋白第100-150區域。建議用戶根據實驗需求驗證其他種屬（如小鼠、大鼠等）的交叉反應性。MAD2在哺乳動物中高度保守，但在使用前仍需通過陽性對照確認。

推薦應用與實驗條件

1. 免疫沉淀（IP）

用量：每毫克細胞裂解液蛋白使用6 ?g抗體

適用樣本：人源細胞裂解液（如HeLa、HEK293、U2OS等）

實驗要點：

裂解液建議使用非變性裂解緩沖液（如含1% NP-40或Triton X-100的TBS或PBS），以維持MAD2與MCC復合物（BubR1、Bub3、Cdc20）的相互作用。

建議設置兔IgG同型對照，以評估非特異性沉淀背景。

洗脫可采用SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸變性，或使用低pH甘氨酸緩沖液進行溫和洗脫。

2. 免疫組織化學（IHC）

推薦稀釋比：1:1,000 至 1:5,000

抗原修復：對于福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織切片，推薦使用檸檬酸緩沖液（pH 6.0）進行熱誘導抗原修復。

適用樣本：人源組織切片（如腫瘤組織、正常增殖組織）

注意事項：MAD2在增殖活躍的細胞中高表達，在靜止期細胞中表達較低。建議使用已知高表達的組織（如扁桃體、睪丸或腫瘤組織）作為陽性對照。

MAD2（MAD2L1）的生物學功能

MAD2（Gene Symbol: MAD2L1，Gene ID: 4085，UniProt ID: Q13257）也稱為有絲分裂紡錘體組裝檢查點蛋白MAD2A，是有絲分裂檢查點的關鍵調節因子。

主要功能：

紡錘體組裝檢查點（SAC）：MAD2定位于未附著的動粒上，感知微管附著狀態和張力。當存在未正確附著的染色體時，MAD2激活并阻止細胞進入后期。

MCC復合物：MAD2與BubR1、Bub3、Cdc20共同組成有絲分裂檢查點復合物（MCC）。該復合物直接結合并抑制后期促進復合物/細胞周期體（APC/C），從而阻止姐妹染色單體分離和細胞周期進展。

調控機制：MAD2的活性和定位受MAD1調控。MAD1將MAD2招募至動粒，并促進MAD2從封閉構象向開放構象的轉換，這是激活檢查點信號所必需的。

與癌癥的關系：MAD2表達異常（過表達或下調）與染色體不穩定性、非整倍體以及多種人類癌癥（如乳腺癌、結直腸癌、肝癌等）的發生發展密切相關。

其他別名：HSMAD2、MAD2、MAD2-like protein 1、MAD2L1、mitotic arrest deficient 2-like protein 1。

技術建議與注意事項

稀釋優化

IHC推薦的1:1,000-1:5,000為起始范圍。由于MAD2在細胞周期中表達水平波動（在G2/M期達到高峰），建議使用同步化細胞（如諾考達唑處理）制備的細胞沉淀石蠟切片或細胞涂片進行預實驗，以確定最佳稀釋比。

IHC抗原修復條件

檸檬酸緩沖液（pH 6.0）是本抗體的推薦修復條件。操作步驟：

修復液：10 mM檸檬酸三鈉，0.05% Tween 20，用HCl調至pH 6.0

修復方式：使用微波爐高火煮沸后轉低火維持15-20分鐘，或使用高壓鍋修復2-3分鐘

自然冷卻至室溫（約20-30分鐘），避免驟冷導致組織脫片

冷卻后用PBS洗滌3次，每次5分鐘

注意：不推薦使用Tris-EDTA（pH 9.0）等高pH修復液，可能導致信號減弱或背景增高。

免疫沉淀策略

研究MAD2在有絲分裂檢查點中的功能時，可采用以下IP策略：

檢測MCC復合物組裝：使用MAD2抗體進行IP，然后WB檢測BubR1、Bub3、Cdc20。建議設置以下對照：

未處理細胞（間期對照）vs 諾考達唑或紫杉醇處理細胞（有絲分裂阻滯對照）

IgG同型對照

檢測MAD2-MAD1相互作用：IP MAD2后WB檢測MAD1，反之亦然。該相互作用在未附著動粒上增強。

樣本同步化：為了捕獲動態相互作用，建議使用雙胸苷阻斷或諾考達唑釋放進行細胞周期同步化。

疊氮化鈉的影響

緩沖液中含0.09%疊氮化鈉。雖然在IP和IHC中影響較小，但需注意：

HRP檢測系統：若IHC使用HRP標記的二抗，疊氮化物會抑制HRP活性。在二抗孵育前通過充分洗滌（3次×5分鐘）去除疊氮化物即可。

長期儲存：疊氮化物作為防腐劑，允許2-8°C長期保存。但如需對抗體進行標記（如生物素化或熒光標記），應通過脫鹽或透析去除疊氮化物。

IHC常見問題排查

問題1：無信號或信號弱

可能原因：抗原修復不充分、抗體稀釋度過高、組織固定過度

解決方案：延長修復時間（微波修復20-25分鐘）；使用更低稀釋比（如1:500）；改用凍存切片；嘗試不同的修復液（如Tris-EDTA pH 9.0，但本抗體未經驗證，需自行測試）

問題2：高背景或彌散染色

可能原因：抗體濃度過高、封閉不充分、內源性過氧化物酶未阻斷（如使用HRP系統）

解決方案：提高稀釋比（1:5000或更高）；延長封閉時間（室溫1小時或4°C過夜）；使用含5%正常山羊血清的封閉液；用3% H?O?處理10分鐘以淬滅內源性過氧化物酶

問題3：核外染色

說明：MAD2在細胞周期中主要定位于細胞核（特別是動粒），但在未附著動粒處呈點狀分布。若出現彌漫性胞質染色，可能是抗體濃度過高或特異性問題。建議降低稀釋比并參考已發表的組織染色圖像。

IP實驗優化提示

裂解液選擇：

標準裂解液：50 mM Tris pH 7.5，150 mM NaCl，1% NP-40，0.5%脫氧膽酸鈉，蛋白酶抑制劑

維持復合物：避免使用SDS；可添加0.1% Triton X-100替代NP-40

交聯：若研究弱相互作用，可考慮使用可逆交聯劑（如DSP）處理細胞，然后在IP后洗脫前解交聯

抗體固定：為減少重鏈污染，可將抗體共價交聯至Protein A/G磁珠后再進行IP

洗滌嚴格性：使用含500 mM NaCl的高鹽洗滌緩沖液可減少非特異性結合