兔抗磷酸化RPA32（S4/S8）抗體親和純化，助力DNA損傷篩查、藥物評價與高通量實驗研究

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的本抗體為兔源多克隆抗體（貨號：A300-245A），特異性靶向RPA32（RPA2）亞基上雙磷酸化的第4位和第8位絲氨酸（pS4/pS8）。RPA（復制蛋白A）是由70 kDa（RPA1）、32 kDa（RPA2）和14 kDa（RPA3）亞基組成的異源三聚體復合物，在DNA復制、重組和修復中發揮核心作用。RPA32的S4/S8磷酸化由ATM、ATR和DNA-PK在DNA損傷時誘導，是激活DNA損傷檢查點和啟動修復的關鍵事件。該抗體使用雙磷酸化合成肽免疫后經抗原親和純化，未偶聯標記，適用于免疫細胞化學/免疫熒光（ICC-IF）、免疫組織化學（IHC）、免疫沉淀（IP）和免疫印跡（WB），且與人、小鼠樣本有交叉反應性。以下將從基本參數、免疫原信息、應用條件、儲存穩定性及生物學背景等方面進行詳細說明。

一、關鍵規格參數

項目 | 詳細內容

靶標 | RPA32 (RPA2) 磷酸化，特異性識別Ser4和Ser8雙磷酸化

反應種屬 | 小鼠、人類

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

抗體形式 | 完整IgG

免疫原 | 合成雙磷酸化肽段，對應人RPA32第4和8位絲氨酸周圍區域（參考序列NP_002937.1，GeneID 6118）

亞型 | IgG

偶聯物 | 未偶聯

純化方式 | 抗原親和純化（使用固定化的磷酸化肽段）

抗原物種 | 人

濃度 | 1000 ?g/mL

緩沖液 | Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液，pH 7~8，含0.09%疊氮鈉

儲存條件 | 2–8 °C

保質期 | 收貨后1年

生產流程 | 親和純化后，通過Beer定律測定IgG濃度（1 mg/mL IgG在A280下吸光值為1.4）

> 注：0.09%疊氮鈉作為防腐劑，在IP后WB使用HRP標記二抗時需注意其抑制作用。建議在IP洗脫或二抗孵育前充分去除疊氮鈉。

二、免疫原與特異性

本抗體采用雙磷酸化合成肽（模擬人RPA32蛋白第4和8位絲氨酸同時磷酸化狀態）作為免疫原。經抗原親和純化（使用相同磷酸化肽段固定于固相載體），確?？贵w對雙磷酸化表位的高特異性。該抗體不識別非磷酸化RPA32，也不識別單磷酸化（僅S4或僅S8）形式，僅特異性檢測S4和S8同時磷酸化的RPA32。經驗證，該抗體可識別人和小鼠樣本中的磷酸化RPA32。建議陽性對照使用經DNA損傷誘導劑（如喜樹堿、依托泊苷、電離輻射）處理的細胞裂解液。

三、推薦應用與實驗條件

以下稀釋度均為起始推薦范圍，用戶需根據具體實驗體系進行優化。

1. 免疫印跡（Western Blot, WB）

稀釋度：1:2000 – 1:10,000  

封閉液及抗體稀釋液：5%脫脂奶粉-TBST（Tris緩沖鹽水+0.1% Tween-20）  

孵育條件：一抗4°C孵育過夜（推薦）  

二抗推薦：  

常規細胞裂解液WB：使用山羊抗兔IgG（重鏈+輕鏈）抗體，如貨號A120-101P。  

免疫沉淀后WB：為避免變性IP產物中重鏈（~55 kDa）信號干擾，推薦使用抗兔IgG輕鏈特異性HRP標記二抗，并在封閉液中添加5%正常豬血清（貨號S100-020）以降低背景。  

陽性對照：用0.5 ?M喜樹堿處理HeLa細胞1小時，或10 Gy γ射線照射后1小時收集的細胞裂解液。磷酸化RPA32分子量約為32 kDa。

2. 免疫組織化學（IHC）

稀釋度：1:500 – 1:2000  

抗原修復：對FFPE（福爾馬林固定、石蠟包埋）組織切片，必須使用pH 6.0的檸檬酸鹽緩沖液進行熱誘導抗原修復。  

推薦對照：使用未處理組織作為陰性對照，或用λ磷酸酶處理切片驗證磷酸化特異性。  

檢測系統：適用于顯色法（DAB）或熒光法IHC。陽性信號通常定位于細胞核。

3. 免疫細胞化學/免疫熒光（ICC-IF）

稀釋度：1:500 – 1:5000  

固定方法：推薦使用甲醛或4%多聚甲醛固定  

通透處理：甲醛固定的細胞建議使用0.1-0.5% Triton X-100進行通透。  

注意事項：建議并行未處理細胞作為陰性對照，DNA損傷誘導后可見核內離散焦點狀信號（RPA焦點）。

4. 免疫沉淀（IP）

用量：6 ?g抗體 / mg總蛋白裂解液  

操作建議：  

裂解液推薦使用非變性裂解緩沖液（如NP-40或RIPA，但避免高濃度SDS），并添加磷酸酶抑制劑（如Na3VO4、β-甘油磷酸酯）以維持磷酸化狀態。  

孵育條件：4°C旋轉孵育2小時或過夜。  

使用Protein A/G瓊脂糖或磁珠捕獲免疫復合物。  

洗脫后通過WB檢測，務必使用抗兔IgG輕鏈特異性二抗以避免重鏈干擾。  

陽性對照：經DNA損傷處理的細胞裂解液。

四、儲存與穩定性

儲存溫度：2–8°C，嚴禁冷凍。反復凍融會導致抗體變性、效價下降。  

運輸條件：濕冰運輸，收貨后請立即按上述溫度保存。  

分裝建議：若需長期使用，建議分裝成小份后存放于2–8°C，避免污染。不可稀釋后長期儲存。  

有效期：自收貨之日起1年。過期產品可能信號減弱，建議重新訂購。  

五、使用建議

A300-245A抗RPA32磷酸化（S4/S8）多克隆抗體是一款經過嚴格磷酸化肽段親和純化、驗證充分的研究工具，適用于人及小鼠樣本的ICC-IF、IHC、IP和WB檢測。其雙磷酸化特異性確保了在DNA損傷研究中的精準報告。為獲得最佳結果，請嚴格遵循以下要點：  

WB：使用5%奶粉-TBST，一抗過夜孵育。必須設置未處理對照以確認磷酸化特異性。  

IP：嚴格按6 ?g抗體/mg裂解液用量，裂解液中必須添加磷酸酶抑制劑。  

IHC/ICC-IF：務必進行檸檬酸緩沖液（pH 6.0）熱修復（IHC）；甲醛固定后需Triton X-100通透（ICC-IF）。陽性處理后的細胞應呈現核焦點。  

陽性對照：喜樹堿（0.5 ?M，1小時）或依托泊苷（25 ?M，1小時）處理的HeLa細胞。