兔抗Paf1多克隆抗體，低背景高信噪比，助力IP-WB聯合應用

Paf1（RNA聚合酶相關因子1，也稱PD2）是真核生物Paf1復合物的核心亞基之一。該復合物最早在酵母中發現并與RNA聚合酶II（RNAP II）相互作用，在轉錄延伸、組蛋白H2B單泛素化、H3甲基化、染色質重塑以及mRNA 3’端加工等多個基因表達調控環節發揮關鍵作用。哺乳動物Paf1復合物參與細胞增殖、分化及腫瘤發生，其中Paf1本身在胰腺癌等多種惡性腫瘤中高表達，被視為潛在的治療靶點。因此，準確檢測Paf1的表達水平、結合蛋白及細胞內定位，對于轉錄調控和腫瘤機制研究至關重要。

本文所介紹的由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗Paf1多克隆抗體（貨號：A300-172A）是針對人Paf1蛋白第75–125位氨基酸區域的特異性抗體，經抗原親和純化，適用于免疫沉淀（IP）和免疫印跡（WB），可識別人和小鼠來源的Paf1。以下從抗體規格、生產純化、實驗應用及性能特征等方面進行詳細說明。

一、抗體核心規格

項目 | 具體參數

靶標 | Paf1（PAF1 homolog, Paf1/RNA polymerase II complex component）

反應性 | 小鼠、人

應用 | IP, WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 全分子IgG

免疫原 | 人Paf1第75–125位氨基酸之間的區域

亞型 | IgG

標記 | 未偶聯

純度 | 抗原親和純化

抗原種屬 | 人

濃度 | 1000 ?g/ml（1 mg/ml）

緩沖液 | Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液，pH 7–8，含0.09%疊氮鈉

儲存條件 | 2–8 °C

有效期 | 收貨后1年

濃度測定方法 | Beer’s Law（A280 1.4對應1 mg/ml IgG）

抗體濃度：1 mg/ml的高濃度設計，滿足IP實驗需要較大抗體量（6 ?g/mg裂解液）以及WB中寬范圍稀釋（1:2000–1:10000）的需求。

防腐劑：含0.09%疊氮鈉，可抑制微生物生長。常規IP/WB實驗不受影響；如需用于活細胞或體內實驗，需通過透析去除。

二、生產與純化工藝

1. 免疫原設計

選擇人Paf1蛋白序列（TrEMBL Q9NUU9，GeneID 54623）中第75–125位氨基酸之間的合成肽段作為免疫原。該區域位于蛋白質N端附近，在人和小鼠中高度保守，因此抗體可同時檢測兩種種屬。此外，該表位不參與已知的蛋白質-蛋白質相互作用界面，有利于識別天然和變性狀態的Paf1。

2. 抗血清制備

采用上述免疫原免疫兔，獲得高滴度多克隆抗血清。

3. 親和純化

將免疫原肽段共價偶聯到固相支持物（如瓊脂糖凝膠）上形成親和層析柱?？寡逋ㄟ^該柱時，特異性識別該表位的抗體被捕獲，經低pH洗脫后得到高純度、高活性的全分子IgG。此過程去除了不識別靶表位的非特異性免疫球蛋白，顯著降低背景。

4. 濃度與緩沖液

純化后的抗體溶于Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液（pH 7–8），并加入0.09%疊氮鈉作為防腐劑。該緩沖體系不含EDTA或高濃度鹽，適合直接用于IP和WB稀釋。

特異性驗證：通過肽段競爭ELISA確認抗體僅識別Paf1第75–125表位，與全長蛋白的其他區域無交叉。敲低實驗（siRNA靶向PAF1）可導致WB中目標條帶消失，進一步驗證特異性。

三、推薦應用與實驗條件

本抗體已驗證適用于免疫沉淀和免疫印跡。以下為廠家推薦的實驗條件及操作要點。

1. 免疫沉淀（IP）

使用量：6 ?g 抗體 / mg 細胞裂解液總蛋白。

例如：取1 mg總蛋白裂解液，加入6 ?l本抗體（濃度1 mg/ml，即6 ?l含6 ?g抗體）。

裂解液選擇：推薦使用非變性裂解液，如含0.5% NP-40或0.5% Triton X-100的Tris緩沖液（pH 7.5），并添加蛋白酶抑制劑（如PMSF、cocktail）。避免使用強變性劑（如SDS）以免破壞Paf1復合物的天然構象。

操作流程：

1. 將裂解液與抗體在4°C旋轉孵育2小時或過夜。

2. 加入40–50 ?l Protein A瓊脂糖珠（預平衡），繼續孵育1–2小時。

3. 離心（2000×g，1分鐘）收集珠子，用裂解液洗滌3–5次。

4. 加入2× SDS上樣緩沖液（含還原劑），95°C加熱5分鐘，離心后取上清進行WB檢測。

陽性對照：人HeLa、293T細胞裂解液或小鼠NIH/3T3細胞裂解液。Paf1在多種細胞系中普遍表達，預期分子量約60–70 kDa（實際大小因物種和修飾略有差異）。

2. Western Blot（WB）

稀釋范圍：1:2000 – 1:10,000

封閉與稀釋液：5%脫脂牛奶 – TBST（Tris緩沖鹽水含0.1% Tween-20）。廠家指定使用5% Milk-TBST作為封閉液和抗體稀釋液，不可替換為BSA或其他成分（可能影響信號強度）。

一抗孵育：4°C孵育過夜。室溫短時間孵育可能導致靈敏度下降，建議嚴格遵循過夜條件。

二抗選擇：

檢測全細胞裂解液：使用山羊抗兔IgG（H+L）HRP標記抗體（如貨號A120-101P），稀釋度通常為1:5000–1:10000。

檢測免疫沉淀產物：由于IP使用兔抗體，其重鏈（~55 kDa）和輕鏈（~25 kDa）會在WB中顯影，可能與目標蛋白Paf1（~65 kDa）或普通IgG輕鏈帶重疊。為此，廠家建議使用抗兔IgG輕鏈特異性HRP標記抗體（可避免重鏈交叉），并在封閉液中加入5%正常豬血清（貨號S100-020）以降低背景。輕鏈抗體僅識別約25 kDa的輕鏈，因此不會干擾60–70 kDa目標區域的檢測。

陽性對照：HeLa或293T全細胞裂解液，上樣量20–50 ?g總蛋白。

3. 實驗注意事項

樣本制備：使用含SDS和還原劑（如DTT或β-巰基乙醇）的上樣緩沖液，95°C加熱5分鐘。

膜類型：推薦使用PVDF膜（需甲醇活化）或硝酸纖維素膜。轉膜后可用麗春紅染色確認轉印效果。

洗滌：TBST洗滌3次，每次5分鐘，確保去除未結合抗體。

四、儲存穩定性

2–8°C條件下可穩定保存1年。請勿冷凍，冷凍會導致抗體聚集和效價下降。如必須長期保存，可分裝后于-80°C凍存（官方未驗證此條件，但許多用戶成功使用；注意避免反復凍融）。