兔抗纖維蛋白原抗體親和純化，突破石蠟切片檢測壁壘

Parafibromin（又稱CDC73、HRPT2）是一種由CDC73基因編碼的腫瘤抑制蛋白，主要作為PAF1復合物的核心組分，與RNA聚合酶II相互作用，參與轉錄延伸及mRNA 3’端加工過程。研究表明，Parafibromin還直接調控細胞周期，其功能喪失與甲狀旁腺功能亢進-頜骨腫瘤綜合征（HPT-JT）、家族性孤立性甲狀旁腺功能亢進（FIHP）以及多種散發性甲狀旁腺癌、腎癌和乳腺癌密切相關。因此，對Parafibromin的表達水平、結合蛋白及亞細胞定位進行準確檢測，對于腫瘤發生機制研究和臨床病理評估具有重要意義。

本文所介紹的由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗Parafibromin多克隆抗體（貨號：A300-170A）是針對人Parafibromin蛋白第250–300位氨基酸區域的特異性抗體，經抗原親和純化，適用于免疫沉淀（IP）和免疫印跡（WB），可識別人和小鼠來源的Parafibromin。以下從抗體規格、生產純化、實驗應用及性能特征等方面進行詳細說明。

一、抗體核心規格

項目 | 具體參數

靶標 | Parafibromin（CDC73）

反應性 | 小鼠、人

應用 | IP, WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 全分子IgG

免疫原 | 人Parafibromin第250–300位氨基酸之間的區域

亞型 | IgG

標記 | 未偶聯

純度 | 抗原親和純化

抗原種屬 | 人

濃度 | 1000 ?g/ml（1 mg/ml）

緩沖液 | Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液，pH 7–8，含0.09%疊氮鈉

儲存條件 | 2–8 °C

有效期 | 收貨后1年

濃度測定方法 | Beer’s Law（A280 1.4對應1 mg/ml IgG）

抗體濃度說明：本產品濃度為1000 ?g/ml（即1 mg/ml），屬于高濃度抗體，適合需要大量抗體的IP實驗以及高稀釋比（1:5000–1:20000）的WB實驗。

防腐劑：含0.09%疊氮鈉，可抑制微生物生長。如需用于活細胞或體內實驗，請通過透析去除疊氮鈉；常規WB/IP（使用已裂解樣本）不受影響。

二、生產與純化工藝

1. 免疫原設計  

選擇人Parafibromin蛋白序列（TrEMBL Q6P1J9）中第250–300位氨基酸之間的合成肽段作為免疫原。該區域位于蛋白質中央功能域附近，在人和小鼠中高度保守，因此抗體可同時檢測兩種種屬。

2. 抗血清制備  

采用該免疫原免疫兔，獲得高滴度多克隆抗血清。

3. 親和純化  

將免疫原肽段共價偶聯到固相支持物（如瓊脂糖凝膠）上，形成親和層析柱?？寡逋ㄟ^該柱時，特異性識別該表位的抗體被捕獲，經洗脫后得到高純度、高活性的全分子IgG。

4. 濃度與緩沖液  

純化后的抗體溶于Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液（pH 7–8），并加入0.09%疊氮鈉作為防腐劑。該緩沖體系不含EDTA或其他干擾免疫沉淀的螯合劑，可直接用于IP和WB稀釋。

特異性驗證：通過肽段競爭ELISA確認抗體僅識別Parafibromin第250–300表位，與全長蛋白的其它區域無交叉。由于該區域并非在PAF1復合物中與其他蛋白相互作用的界面，故抗體可有效識別天然構象和變性后的Parafibromin。

三、推薦應用與實驗條件

本抗體已驗證適用于免疫沉淀和免疫印跡。以下為廠家推薦的實驗條件及操作要點。

1. 免疫沉淀（IP）

使用量：6 ?g 抗體 / mg 細胞裂解液總蛋白。

例如：取1 mg總蛋白裂解液，加入6 ?l本抗體（因為濃度1 mg/ml，即6 ?l含6 ?g抗體）。

裂解液選擇：推薦使用非變性裂解液（如RIPA緩沖液或含0.5% NP-40、0.5% Triton X-100的Tris緩沖液），并添加蛋白酶抑制劑（如PMSF、cocktail）。

操作流程：

1. 將裂解液與抗體在4°C旋轉孵育2小時或過夜。

2. 加入40–50 ?l Protein A/G瓊脂糖珠（預平衡），繼續孵育1–2小時。

3. 離心收集珠子，用裂解液洗滌3–5次。

4. 加入2× SDS上樣緩沖液，95°C加熱5分鐘，離心后取上清進行WB檢測。

陽性對照：人HeLa細胞裂解液、293T細胞裂解液或小鼠NIH/3T3細胞裂解液。Parafibromin在多種細胞系中普遍表達。

2. Western Blot（WB）

稀釋范圍：1:5000 – 1:20,000

封閉與稀釋液：5%脫脂牛奶 – TBST（Tris緩沖鹽水含0.1% Tween-20）。廠家指定使用5% Milk-TBST作為封閉液和抗體稀釋液。

一抗孵育：4°C孵育過夜（廠家推薦條件）。室溫短時間孵育可能導致信號減弱，建議嚴格遵循過夜條件。

二抗選擇：

檢測全細胞裂解液：使用山羊抗兔IgG（H+L）HRP標記抗體（如貨號A120-101P）。

檢測免疫沉淀產物：由于IP使用兔抗體，其重鏈（~55 kDa）和輕鏈（~25 kDa）會在WB中顯影，可能與目標蛋白（Parafibromin分子量約70 kDa）或普通IgG輕鏈帶（~25 kDa）重疊。為此，廠家建議使用抗兔IgG輕鏈特異性HRP標記抗體（可避免重鏈交叉），并在封閉液中加入5%正常豬血清（貨號S100-020）以降低背景。

陽性對照：HeLa或293T全細胞裂解液，上樣量20–50 ?g總蛋白。目標蛋白預期分子量約60–70 kDa（實際觀察可能有微小差異，取決于翻譯后修飾）。

3. 實驗注意事項

樣本制備：使用含SDS和還原劑的變性上樣緩沖液，95°C加熱5分鐘。建議同時上樣未誘導或敲低的陰性對照。

膜類型：推薦使用PVDF或硝酸纖維素膜。轉膜后可用麗春紅染色確認轉印效率。

洗滌：TBST洗滌3次，每次5分鐘。

四、儲存穩定性  

2–8°C條件下可穩定保存1年。請勿冷凍，冷凍會導致抗體聚集和效價下降。如必須長期保存，可分裝后于-80°C凍存（官方未驗證此條件，但許多用戶成功使用；注意避免反復凍融）。