山羊抗RENT1抗體親和純化，超靈敏檢測，大幅節省抗體用量

一、產品概述

本文介紹一款由艾美捷Bethyl Laboratories推出的針對人RENT1（又稱UPF1）的山羊多克隆抗體，產品編號A300-038A。該抗體特異性識別RENT1蛋白第1079位至C端（第1118位）之間的表位，經抗原親和純化后以完整IgG形式提供，未偶聯標記物。已驗證反應種屬為人及小鼠，推薦應用于免疫沉淀（IP）及免疫印跡（WB）。

RENT1（Regulator of Nonsense Transcripts 1）是無義介導的mRNA降解（NMD）通路的關鍵調控因子，作為ATP依賴的RNA解旋酶參與異常轉錄本的清除?？煽康奶禺愋钥贵w對于研究NMD機制、RNA質量控制及相關疾?。ㄈ邕z傳病中的無義突變逃逸）至關重要。

二、詳細規格參數

參數 | 信息

靶標 | RENT1（UPF1）

反應種屬 | 小鼠、人

應用 | IP, WB

宿主 | 山羊

克隆性 | 多克隆

形式 | 完整IgG

免疫原 | 第1079位至C端之間

亞型 | IgG

偶聯物 | 未偶聯

純度 | 抗原親和純化

免疫原種屬 | 人

濃度 | 1000 ?g/ml

存儲條件 | 2–8 °C

有效期 | 收貨后1年

緩沖液 | Tris-檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液，pH 7–8，含0.09%疊氮化鈉

三、抗原表位與生產信息

該抗體識別的人RENT1（UPF1）表位位于第1075–1118殘基之間的C端區域，參考序列號為NP_002902.2（GeneID 5976）。免疫原對應第1079位至C端。

選擇C端區域作為免疫原的策略具有明確優勢：UPF1的N端富含半胱氨酸/組氨酸區域（鋅指樣結構）及中央解旋酶核心結構域在多種物種中高度保守，而C端區域相對獨特，有助于降低與其它RNA解旋酶家族成員的交叉反應。

純化工藝采用固相載體固定的表位特異性親和層析，僅富集針對該C端表位的高親和力IgG分子。免疫球蛋白濃度通過比爾定律測定（1 mg/mL IgG在A280處的吸光度為1.4）。

四、應用方法與推薦條件

4.1 免疫印跡（WB）

推薦稀釋比：1:10,000 至 1:25,000（極寬范圍）

通用條件：

封閉液及抗體稀釋液：含5%脫脂牛奶的TBST

一抗孵育：4°C過夜

檢測二抗：驢抗山羊IgG（重鏈+輕鏈）HRP偶聯抗體（貨號A50-101P）

樣品制備建議：

UPF1分子量約124–130 kDa（受磷酸化修飾影響），建議使用6–8% SDS-PAGE或3–8% Tris-乙酸酯凝膠以獲得良好分辨率。

使用人或小鼠細胞裂解液（如HeLa、HEK293T、NIH/3T3）作為陽性對照。已知UPF1廣泛表達于各種細胞系。

推薦上樣量：20–40 ?g總蛋白/泳道。

轉印與曝光：

轉膜使用PVDF膜（預先甲醇活化）或0.45 ?m硝酸纖維素膜。

由于稀釋比極高（1:10,000起步），UPF1表達豐度中等，建議使用高靈敏度ECL底物。曝光時間可從30秒至10分鐘調整。

注意事項：

該抗體檢測的是C端表位，因此對于UPF1的C端截短突變體可能無法識別，需結合實驗設計判斷。

驗證種屬：已確認人和小鼠，對于大鼠或其他物種需自行測試。

4.2 免疫沉淀（IP）

推薦用量：6 ?g 抗體 / mg 蛋白裂解液

根據抗體濃度1000 ?g/ml換算，6 ?g對應6 ?l抗體。操作流程如下：

1. 細胞裂解：建議使用非變性裂解緩沖液（如含0.5% NP-40、150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl pH 7.4，添加蛋白酶及磷酸酶抑制劑），保留RNA結合活性。

2. 預清除：裂解液與10 ?l蛋白G瓊脂糖珠及1 ?g同型山羊IgG孵育1小時，離心去除非特異性結合。注意：山羊抗體對蛋白G親和力高，推薦使用蛋白G而非蛋白A。

3. 免疫沉淀：預清除后的上清中加入6 ?g A300-038A抗體，4°C旋轉孵育2小時或過夜。

4. 捕獲：加入20–30 ?l蛋白G瓊脂糖珠，繼續孵育1–2小時。

5. 洗滌：使用裂解緩沖液洗滌珠子3–5次，可逐漸提高鹽濃度（至300 mM NaCl）降低背景。

6. 洗脫：加入2× SDS上樣緩沖液（含DTT），煮沸5–10分鐘，離心后取上清進行WB檢測。

IP產物WB檢測的特殊注意事項：

由于IP使用山羊一抗，WB檢測時二抗推薦使用驢抗山羊IgG（H+L）HRP（A50-101P）。若擔心重鏈干擾（約55 kDa），可選用抗山羊IgG輕鏈特異性HRP二抗，但說明書中未強制要求，因山羊抗體的重鏈與目標UPF1（124 kDa）距離較遠，干擾較小。

4.3 關于物種兼容性的補充

本抗體可用于小鼠樣本。建議使用小鼠成纖維細胞（如NIH/3T3）或小鼠胚胎干細胞裂解液作為陽性對照。小鼠UPF1與人UPF1的C端區域高度保守（根據序列比對，同源性約95%），因此預期可良好識別。

五、儲存與穩定性

未稀釋抗體必須儲存于2–8°C，嚴禁冷凍。冷凍會導致山羊IgG聚集和活性喪失。在推薦條件下，自收貨之日起可穩定保存1年。

緩沖液中含有0.09%疊氮化鈉作為防腐劑。若后續IP產物擬用于活細胞功能實驗或質譜分析，需通過脫鹽柱或透析去除疊氮化鈉。分裝建議：無需分裝，原瓶冷藏；若需長期頻繁使用，可無菌分裝至低蛋白吸附管中，但仍需冷藏，不可凍存。