ALPCO胰島素ELISA測定程序及結果計算方案

ALPCO胰島素ELISA用于定量測定血清和血漿中的胰島素。

艾美捷胰島素ELISA（ALP-80-INSHU-E01.1）檢測原理：

ALPCO胰島素ELISA是一種夾心型免疫測定法。96孔微孔板涂有胰島素特異性單克隆抗體。將標準品、對照品和樣品加入帶有檢測抗體的微孔板孔中。然后將微孔板在酰胺板振蕩器上以700-900rpm的速度孵育。第一次孵育完成后，用洗滌緩沖液洗滌孔并吸干。加入TMB底物，在微孔板振蕩器上以700-900rpm的速度第二次孵育微孔板。一旦第二次孵育完成，加入停止溶液，用分光光度計在450nm處測量光密度（OD）。產生的顏色強度與樣品中胰島素的量成正比。

胰島素ELISA測定程序：

所有試劑和微孔板條在使用前應平衡至室溫（18-25°C）。使用前輕輕混合所有試劑。每次測定運行和每次使用多個微孔板時，都必須執行標準曲線。所有標準品、對照品和樣本都應雙重運行。

1. 在打開鋁箔袋前，應先將微孔板平衡至室溫。為標準品、對照品和樣本的雙重測定分配足夠的微孔板條。其余的微孔板條應存放在含干燥劑的密封鋁箔袋中，置于2-8°C。

2. 將每個標準品、對照品和樣本的25微升分別吸入相應的孔中。見試劑準備部分以獲取對照品重組說明。

3. 向每個孔中加入100微升的檢測抗體。

4. 用板封膜覆蓋微孔板，在室溫下孵育1小時，在微孔板振蕩器上以700-900轉每分鐘的速度搖動。

5. 倒掉孔中的內容物，使用微孔板洗滌器用每次350微升的工作強度洗滌緩沖液洗板6次（見試劑準備）。或者，使用洗滌瓶（不要使用多通道移液管）將工作強度洗滌緩沖液注入孔中。每次洗滌之間，將微孔板倒置以丟棄液體，并在吸水紙上用力拍打倒置的微孔板。在最后洗滌后（自動或手動），通過倒置并用力拍打微孔板在吸水紙上，去除孔中的任何殘留洗滌緩沖液和氣泡。

6. 向每個孔中加入100微升的TMB底物。

7. 用板封膜覆蓋微孔板，在室溫下孵育15分鐘，在微孔板振蕩器上以700-900轉每分鐘的速度搖動。

8. 向每個孔中加入100微升的終止溶液，并輕輕搖動微孔板以混合內容物。在進行下一步之前，去除任何氣泡。

9. 將微孔板放入能夠讀取450納米吸光度的微孔板閱讀器中。在加入終止溶液后應立即分析微孔板，且不得超過30分鐘。

胰島素ELISA結果計算：

從標準品中構建標準曲線。零標準應作為空白，其平均值從每個孔中減去。建議使用軟件程序來計算標準曲線并確定樣本的濃度。胰島素ELISA是一種配體結合測定，其響應與分析物濃度呈現S形關系。目前被普遍接受的此類曲線的參考模型使用4或5參數邏輯（pl）擬合，因為這些模型可以在更大的范圍內優化準確性和精確度。盡管三次樣條和其他模型是可以接受的方法，但它們通常在范圍的低端和高端顯示出較低的測定內準確性和精確度。在以下示例中，使用了5參數邏輯擬合來最大化低濃度樣本的準確性和精確度。然而，由于個別實驗室條件的影響，所有模型在可檢測范圍的最低端和最高端的準確性和精確度都是有限的。因此，在解釋分析物響應變得非線性時所得出的結果時，應始終謹慎。

胰島素ELISA文獻參考：

Finlay JWA, Dillard RF. Appropriate Calibration Curve Fitting in Ligand Binding Assays. AAPS Journal. 2007; 9(2): E260-E267.