在嚙齒類動物和非人靈長類動物中評估 GalNAc偶聯的siRNAs的口服遞送

口服給藥的重要性與挑戰

口服給藥是醫學中最廣泛使用且便捷的給藥途徑，尤其適用于慢性病患者。然而，對于親水性大分子藥物（如核酸類藥物），口服給藥面臨著腸道滲透性差和胃腸道（GI）降解等挑戰。盡管肽類藥物的口服給藥形式已取得臨床進展，但反義寡核苷酸（ASOs）和小干擾RNA（siRNAs）等核酸類藥物的口服生物利用度仍較低。

siRNAs的潛力與挑戰

siRNAs通過內源性的RNA干擾（RNAi）途徑有效且安全地下調疾病相關mRNA，已成為治療罕見病和常見病的新型藥物類別。然而，siRNAs的大分子尺寸、高負電性和親水性使其難以通過口服途徑給藥。盡管已有研究表明納米顆粒介導的siRNA口服給藥在動物模型中顯示出治療潛力，但納米顆粒系統需要克服復雜的生物屏障以實現高效的口服遞送。

GalNAc偶聯的 siRNAs的優勢

GalNAc（N-乙酰半乳糖胺）偶聯的siRNAs通過靶向肝細胞表面的去唾液酸糖蛋白受體（ASGPR）實現高效遞送。這種修飾顯著提高了siRNAs的藥代動力學/藥效學（PK/PD）特性和安全性，是當前肝靶向RNAi藥物的主流設計。因此，Alnylam制藥公司的研究者在《Evaluating the oral delivery of GalNAc-conjugated siRNAs in rodents and non-human primates》中探索了GalNAc偶聯的siRNAs通過口服途徑給藥的可能性。

實驗方法

1. siRNAs的合成與修飾：研究中所用的GalNAc偶聯的 siRNAs在MerMade合成儀上根據已發表的序列進行合成，并通過多種化學修飾提高其穩定性和靶向性。這些修飾包括2'-O-甲基化、2'-脫氧-2'-氟化、硫代磷酸酯連接等，以增強siRNAs的代謝穩定性和體內活性。

2. 口服給藥制劑的開發：為提高siRNAs的腸道滲透性，研究者探索了多種滲透增強劑（PEs）。這些PEs包括中鏈脂肪酸（如C10、C8、C12等）、螯合劑（如EDTA、檸檬酸）和膽鹽等。通過比較不同PEs對siRNA口服吸收的影響，最終選擇C10作為進一步研究的滲透增強劑。C10因其已被FDA批準為食品添加劑，且在臨床前和臨床試驗中廣泛應用，具有良好的安全性和有效性。

3. 動物實驗設計

小鼠實驗：采用C57BL/6小鼠作為模型動物，通過口服灌胃給予GalNAc-conjugated siRNAs（與C10共配制）。監測血清中目標蛋白（如F12、TTR等）的水平變化，評估siRNA的敲低效果。同時，研究了不同PEs、劑量和給藥次數對siRNA活性的影響。

非人靈長類動物（NHP）實驗：選用食蟹猴作為模型動物，通過口服灌胃或皮下注射給予GalNAc-conjugated siRNAs。監測血漿和肝臟中siRNA的暴露水平及目標蛋白的敲低效果，同時評估藥物的藥代動力學特性。

4. ELISA試劑盒的應用：在動物實驗中，使用了ALPCO品牌的小鼠前白蛋白（TTR）ELISA試劑盒（貨號：41-PALMS-E01）來監測血漿中TTR蛋白的水平。該試劑盒具有高靈敏度、高特異性和操作簡便等優點，能夠準確測量血漿樣本中TTR蛋白的濃度，從而評估siRNA的敲低效果。通過定期采集小鼠和食蟹猴的血漿樣本，并使用該試劑盒進行檢測，研究者能夠實時監測目標蛋白的變化情況，從而評估siRNA的敲低效果和藥代動力學特性。

實驗結果

1. 小鼠實驗中的siRNA活性

口服給予GalNAc-conjugated siRNAs（與C10共配制）后，小鼠血清中的目標蛋白水平顯著下降，表明siRNAs通過口服途徑被有效吸收并發揮作用。

不同PEs對siRNA口服吸收的影響各異，其中C10表現出最佳效果。通過比較不同PEs處理的動物組之間的目標蛋白水平變化，研究者發現C10能夠顯著提高siRNA的腸道滲透性。

劑量和給藥次數的優化實驗表明，多次小劑量給藥可能優于單次大劑量給藥。這可能是由于多次給藥能夠持續維持腸道內的PEs濃度，從而提高siRNA的滲透效率。

2. NHP實驗中的siRNA活性與藥代動力學

在NHP中，口服給予的GalNAc-conjugated siRNAs同樣表現出顯著的敲低效果。盡管生物利用度相對較低（約1.4-2.0%），但目標蛋白水平的變化趨勢與皮下注射組相似，表明口服給藥的siRNAs能夠在體內發揮作用。

血漿和肝臟的藥代動力學分析顯示，口服給予的siRNAs迅速進入血液循環并主要分布于肝臟。這一結果與小鼠實驗結果一致，進一步證實了GalNAc偶聯技術在提高siRNA靶向性和滲透性方面的有效性。

3. ALPCO ELISA試劑盒的作用

高靈敏度與特異性：ALPCO的ELISA試劑盒能夠準確測量血漿中TTR蛋白的微小變化，為評估siRNA的敲低效果提供了可靠的數據支持。

便捷性：該試劑盒操作簡單、快速，適合大規模動物實驗中的樣本檢測。

標準化：試劑盒遵循嚴格的質量控制標準，確保了實驗數據的準確性和可重復性。

結論與討論

本研究首次系統評價了GalNAc-conjugated siRNAs在嚙齒類動物和非人靈長類動物中的口服給藥效果。盡管口服給藥的生物利用度相對較低，但研究結果表明通過優化PEs、劑量和給藥次數等條件，GalNAc-conjugated siRNAs有望實現有效的口服遞送。

1. 口服給藥途徑的潛力與挑戰

口服給藥作為一種理想的給藥途徑，具有患者依從性好、成本低廉等優點。然而，對于大分子藥物如siRNAs而言，其腸道滲透性差和易降解的特性限制了口服給藥的應用。本研究通過引入GalNAc偶聯技術和滲透增強劑C10，顯著提高了siRNAs的口服生物利用度，為siRNAs的口服給藥提供了新的思路和方法。

2. ALPCO ELISA試劑盒的作用與價值

在本研究中，ALPCO品牌的小鼠前白蛋白ELISA試劑盒（貨號：41-PALMS-E01）發揮了關鍵作用。該試劑盒具有高靈敏度、高特異性和操作簡便等優點，能夠準確測量血漿樣本中TTR蛋白的濃度，為評估siRNA的敲低效果和藥代動力學特性提供了可靠的數據支持。此外，該試劑盒還適用于大規模動物實驗中的樣本檢測，提高了實驗效率和準確性。

3. 未來研究方向

未來的研究將進一步探索提高siRNA口服生物利用度的方法。一方面可以開發新型滲透增強劑或載體系統以提高siRNA的腸道滲透性；另一方面可以優化制劑配方和給藥策略以實現更高效的口服遞送。同時隨著基因編輯技術和合成生物學的發展，未來有望開發出更加穩定和高效的siRNA分子以適應口服給藥的需求。這些努力將有助于推動siRNAs在臨床治療中的廣泛應用并造福更多患者。