FBXL10均相檢測試劑盒：基于AlphaLISA技術的組蛋白去甲基化酶活性篩選工具

FBXL10（F-box and leucine-rich repeat protein 10），又稱KDM2B、JHDM1B或CXXC2，是一種組蛋白賴氨酸去甲基化酶，能夠特異性催化組蛋白H3第4位三甲基賴氨酸（H3K4me3）和第36位二甲基賴氨酸（H3K36me2）的去甲基化反應。作為多梳抑制復合物（PRC）的組成部分，FBXL10在細胞增殖、分化和遷移中發揮關鍵調控作用。研究表明，FBXL10在彌漫性大B細胞淋巴瘤（DLBCL）中具有致癌活性，但在某些細胞類型中又表現為腫瘤抑制功能，提示其作用具有細胞類型依賴性。深入解析FBXL10的生物學功能及其在癌癥發生發展中的雙重角色，將為腫瘤治療提供新靶點和新策略。

為滿足科研人員在FBXL10酶活性檢測、抑制劑篩選及藥物發現中的需求，由艾美捷代理BPS Bioscience公司推出的FBXL10 (KDM2B) 均相檢測試劑盒（貨號：50610）提供了一套基于AlphaLISA技術的高靈敏度、高通量兼容的解決方案。該試劑盒以96孔或384孔板格式提供，包含純化的重組FBXL10酶、特異性抗體、生物素化底物及優化緩沖液，支持100次或400次酶反應，適用于酶動力學研究及小分子抑制劑的高通量篩選（HTS）。

圖1：FBXL10（KDM2B）均相檢測試劑盒原理。

首先，將含有FBXL10酶的樣本與生物素化底物一起孵育。接著，加入受體珠和一抗，然后加入供體珠。α計數與去甲基酶活性成正比。

一、檢測原理：基于AlphaLISA的均相免洗技術

本試劑盒采用AlphaLISA（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay） 技術，這是一種基于化學發光的均相檢測方法，無需洗滌步驟，具有極高的靈敏度和寬廣的動態范圍。

檢測流程分為兩個關鍵步驟：

第一步：酶催化去甲基化反應。 將重組FBXL10酶與生物素化組蛋白H3肽底物（含H3K4me3或H3K36me2修飾）共同孵育。在酶活性存在下，底物上的甲基被移除，產生去甲基化的肽產物。

第二步：AlphaLISA信號檢測。 反應結束后，依次加入：

兔源一抗：特異性識別去甲基化后的表位（即僅在甲基被移除后暴露的抗原表位）。

AlphaLISA Anti-Rabbit IgG Acceptor Beads（受體微球）：偶聯有抗兔IgG抗體。

AlphaScreen Streptavidin Donor Beads（供體微球）：通過鏈霉親和素與生物素化底物結合。

當底物被FBXL10去甲基化后，一抗與去甲基化表位結合，進而通過二抗將受體微球招募至同一復合物。此時，供體微球（結合于底物的生物素端）與受體微球（結合于抗體端）在空間上相互靠近。在680 nm激光激發下，供體微球產生單線態氧；若兩種微球距離小于200 nm，單線態氧可傳遞至受體微球，觸發其發出615 nm的化學發光信號。發光強度與FBXL10的去甲基化酶活性成正比。若化合物抑制FBXL10活性，去甲基化產物減少，一抗無法結合，受體微球不能被招募，信號降低。

關鍵優勢：AlphaLISA技術無需洗滌，操作簡單（“加樣-混合-孵育-讀數”），背景極低，靈敏度可達fmol級，動態范圍超過4個數量級，完美兼容自動化高通量篩選。

二、試劑盒核心組分與設計優勢

1. 即用型完整組分（需自購Alpha微球）

試劑盒提供以下核心組分（注意：AlphaLISA受體微球和AlphaScreen供體微球需單獨向PerkinElmer購買）：

純化的重組人FBXL10（KDM2B）酶：保留完整去甲基化酶活性。

生物素化組蛋白H3肽底物：含特定甲基化修飾（H3K4me3或H3K36me2）。

兔源一抗：特異性識別去甲基化表位。

10× 檢測緩沖液：優化pH和離子組成，確保酶反應及AlphaLISA信號穩定。

微孔板：可選OptiPlate-96或OptiPlate-384（PerkinElmer）。

2. 96孔/384孔雙規格，靈活適配不同通量

該試劑盒提供96孔（100次酶反應）和384孔（400次酶反應）兩種規格，用戶可根據實驗規模靈活選擇：

96孔規格：適合常規實驗、方法開發及中小規模抑制劑篩選。

384孔規格：適合高通量篩選（HTS），單位反應成本更低，與自動化移液工作站完美兼容。

3. 內置對照（建議自行配置）

雖然試劑盒本身未提供陽性對照抑制劑，但研究人員可使用已知的組蛋白去甲基化酶抑制劑（如CPI-455，針對KDM5家族，但對FBXL10有參考價值）或自行驗證的化合物作為陽性對照。建議在每次實驗中設置無酶對照（背景信號）和無抑制劑對照（最大信號），以確保數據的可靠性。

三、應用場景與科研價值

1. FBXL10抑制劑的高通量篩選

FBXL10在DLBCL、膠質瘤等多種腫瘤中高表達，其去甲基化酶活性促進腫瘤細胞增殖和遷移。利用該試劑盒，研究人員可以：

在96孔或384孔板中快速篩選數千個化合物，評估其對FBXL10去甲基化酶活性的抑制效果。

通過劑量-反應曲線測定IC50值，比較不同化合物的抑制效力。

篩選FBXL10選擇性抑制劑（與其他KDM家族成員進行正交篩選），為開發靶向FBXL10的抗腫瘤藥物提供先導化合物。

2. 酶動力學研究

利用試劑盒中的純化重組酶和生物素化底物，研究人員可以：

通過改變底物濃度，測定FBXL10的米氏常數（Km）及最大反應速率（Vmax）。

分析不同突變體（如與癌癥相關的FBXL10突變）對酶活性的影響。

研究FBXL10與其他PRC復合物組分（如RING1B、BMI1）相互作用對酶活性的調節。

3. 構效關系（SAR）研究

在藥物化學優化階段，該試劑盒可用于評估系列化合物（如小分子類似物、PROTAC分子）對FBXL10的抑制活性，快速篩選出活性最優的候選化合物，指導藥物設計。

4. 表觀遺傳調控機制研究

FBXL10不僅催化組蛋白去甲基化，還通過其CXXC結構域結合非甲基化CpG島，參與基因轉錄調控。利用該試劑盒，研究人員可以定量分析不同細胞狀態（如分化、應激、藥物處理）下FBXL10的酶活性變化，揭示其在表觀遺傳調控網絡中的功能。

四、操作要點（典型步驟）

1. 準備試劑：將FBXL10酶、生物素化底物、一抗及檢測緩沖液從-80°C取出，冰上融化。注意避光保存Alpha微球。

2. 配制反應混合液：根據說明書稀釋FBXL10酶至工作濃度。

3. 酶反應：在微孔板中加入檢測緩沖液、待測化合物（或抑制劑）、FBXL10酶和生物素化底物，混勻后37°C孵育60-120分鐘。

4. 一抗結合：加入兔源一抗，室溫孵育30-60分鐘。

5. Alpha微球加入：在避光條件下加入AlphaLISA受體微球和AlphaScreen供體微球（需預先稀釋至工作濃度），室溫避光孵育30-60分鐘。

6. 讀數：使用AlphaScreen兼容的熒光微孔板讀數儀，在680 nm激發波長下檢測615 nm發射光強度。

7. 數據分析：計算抑制率 =（1 - 樣品信號值 / 無抑制劑對照信號值）× 100%，使用非線性回歸擬合IC50曲線。

五、文獻參考

Iwase S., et al., 2007 Cell 128(6):1077-1088.

Zhao X., et al., 2018 Cell Death Dis. 9(2):46.