熒光法HDAC6檢測試劑盒：均相免洗，適用于高通量篩選與酶動力學研究

組蛋白去乙酰化酶（HDACs）通過催化乙?；鞍字幸阴Ｙ嚢彼岬乃夥磻?，調控基因轉錄、細胞周期、分化及凋亡等多種關鍵生物學過程。HDAC6是HDAC家族中的獨特成員，主要定位于細胞質，其底物包括α-微管蛋白、Hsp90及皮質蛋白等非組蛋白，在細胞骨架動力學、蛋白降解及免疫應答中發揮重要作用。HDAC6的異常表達與多種疾病密切相關，包括癌癥、神經退行性疾病、炎癥及自身免疫病，因此成為藥物研發的重要靶點。

為滿足科研人員在HDAC6活性檢測、抑制劑篩選及藥物發現中的需求，由艾美捷代理的BPS Bioscience公司推出的熒光法HDAC6檢測試劑盒（貨號：50076）提供了一套完整、靈敏、高通量兼容的解決方案。該試劑盒基于獨特的熒光底物與顯影劑組合，徹底摒棄了傳統HDAC檢測方法中涉及的放射性同位素、萃取及層析等繁瑣步驟，僅需兩步簡單操作即可完成酶活性分析，極大地簡化了實驗流程。

一、檢測原理：基于淬滅/去淬滅的熒光法

本試劑盒采用熒光共振能量轉移（FRET）原理，具體檢測流程分為兩個步驟：

第一步：酶催化去乙?；?。 將熒光染料標記的乙酰化賴氨酸肽底物與純化的HDAC6酶共同孵育。完整底物中，熒光染料因與肽鏈的特定相互作用而發生淬滅，此時底物幾乎不發出熒光。HDAC6特異性催化水解底物中賴氨酸殘基上的乙?；?，生成去乙?；碾漠a物。

第二步：顯影與熒光釋放。 加入賴氨酸特異性顯影劑（Lysine Developer），該顯影劑僅識別去乙?；馁嚢彼釟埢Ｒ坏┡c去乙?；慕Y合，顯影劑便會釋放出熒光染料，使其恢復熒光特性。熒光強度與HDAC6的酶活性成正比。

與傳統HDAC檢測方法相比，該試劑盒采用均相檢測模式，無需放射性標記、無需有機溶劑萃取、無需色譜分離，僅需“加樣-混合-孵育-讀數”四個步驟即可完成檢測，尤其適合高通量篩選（HTS）應用。

二、試劑盒核心組分與設計優勢

1. 即用型完整組分，操作高效

試劑盒提供所有必需成分，用戶無需額外準備酶或底物：

純化的重組人HDAC6酶（GST-tag，Sf9細胞表達），保留完整催化活性。

熒光底物（Fluorogenic HDAC Substrate 3），含乙?；嚢彼醾孺湹臒晒獯銣珉?。

2× HDAC顯影劑，含強效HDAC抑制劑Trichostatin A（TSA），兼具顯影與陽性/陰性對照功能。

HDAC檢測緩沖液，優化pH及離子組成，確保酶反應在最適條件下進行。

黑色低吸附微孔板（96孔或384孔，根據規格選配）。

2. 內置陽性/陰性對照：Trichostatin A

試劑盒中的2× HDAC顯影劑含有Trichostatin A（TSA） ，TSA是一種廣譜強效HDAC抑制劑（對HDAC6的IC50約為nM級），同時作為：

陽性對照：用于驗證實驗體系的有效性，確認酶活性檢測系統正常工作。

陰性對照：在顯影步驟中抑制任何殘留HDAC6活性，確保顯影信號的穩定性和特異性。

3. 96孔/384孔雙規格，靈活適配不同通量

該試劑盒提供96孔（100次酶反應，貨號50076-1）和384孔（384次酶反應，貨號50076-2）兩種規格。用戶可根據實驗規模靈活選擇：

96孔規格：適合常規實驗、方法開發及中小規模抑制劑篩選。

384孔規格：適合高通量篩選（HTS），單位反應成本更低，與自動化移液工作站完美兼容。

三、應用場景與科研價值

1. HDAC6抑制劑的高通量篩選

HDAC6選擇性抑制劑（如ACY-1215、Tubastatin A）在腫瘤、神經退行性疾病及炎癥性疾病中展現出治療潛力。利用該試劑盒，研究人員可以：

在96孔或384孔板中快速篩選數千個化合物，評估其對HDAC6活性的抑制效果。

通過劑量-反應曲線測定IC50值，比較不同化合物的抑制效力。

篩選HDAC6選擇性抑制劑（與其他HDAC家族成員進行正交篩選）。

2. 酶動力學研究

利用試劑盒中的純化重組酶和底物，研究人員可以：

通過改變底物濃度，測定HDAC6的米氏常數（Km）及最大反應速率（Vmax）。

分析不同突變體（如與疾病相關的HDAC6突變）對酶活性的影響。

研究HDAC6與其他蛋白（如Hsp90、dynein）相互作用對酶活性的調節。

3. 構效關系（SAR）研究

在藥物化學優化階段，該試劑盒可用于評估系列化合物的構效關系，快速篩選出活性最優的候選化合物，指導藥物設計。

4. 細胞裂解液中HDAC6活性檢測

試劑盒同樣適用于檢測細胞裂解液中的HDAC6活性。研究人員可通過免疫沉淀或亞細胞分級分離富集HDAC6，然后使用該試劑盒定量分析不同處理條件下（如藥物處理、基因敲除）的HDAC6活性變化。

四、技術參數與操作要點

規格與儲存

檢測格式：熒光法（96孔或384孔）。

激發/發射波長：350-380 nm / 440-460 nm。

物種：人源。

靶點：HDAC6（UniProt Q9UBN7）。

運輸溫度：-80°C（干冰）。

穩定性：按照指示儲存，試劑盒在收貨后6個月內保持最佳性能。試劑盒各組分儲存條件不同，請務必根據說明書存放。

監管狀態：僅限研究使用（Research Use Only），不可用于臨床診斷。

操作流程概述（典型步驟）

1. 準備試劑：將HDAC6酶、熒光底物及檢測緩沖液從-80°C取出，冰上融化。

2. 配制反應混合液：根據說明書稀釋HDAC6酶至工作濃度。

3. 酶反應：在微孔板中加入檢測緩沖液、待測化合物（或抑制劑）、HDAC6酶和熒光底物，混勻后37°C孵育30-60分鐘。

4. 顯影：加入2× HDAC顯影劑（含TSA），混勻后室溫孵育10-15分鐘。

5. 讀數：使用熒光酶標儀在激發/發射波長360 nm/460 nm處讀取熒光強度。

6. 數據分析：計算抑制率 =（1 - 樣品熒光值 / 無抑制劑對照熒光值）× 100%，使用非線性回歸擬合IC50曲線。

五、文獻參考

1. Santo, L., et al., Blood. 2012 Mar 15;119(11):2579-89.

2. Bradner, J.E., et al., Nat Chem Biol. 2010 Mar;6(3): 238-243.