Mabtech：ELISpot Plus: Mouse IFN-γ (ALP)

在癌癥免疫療法領域，免疫檢查點阻斷療法（Checkpoint Blockade Therapy）已成為一種具有顯著臨床效益的治療手段，尤其是對于多種惡性腫瘤患者。該療法通過靶向細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4（CTLA-4）和程序性死亡受體-1（PD-1）等免疫調節受體，能夠重新激活被腫瘤誘導的免疫抑制所抑制的T細胞，從而實現對腫瘤的有效控制。然而，關于這類療法所激活的T細胞所針對的腫瘤抗原的具體身份，以及這些抗原是否能被用于開發高度腫瘤特異性的疫苗，目前尚知之甚少。

在一項研究中，華盛頓大學的研究人員在《Nature》雜志上發表了名為“ Checkpoint Blockade Cancer Immunotherapy Targets TumourSpecific Mutant Antigens”的文章。文章旨在通過基因組學和生物信息學方法，鑒定在接受αPD-1和/或αCTLA-4治療的、攜帶進行性生長肉瘤的小鼠模型中，腫瘤特異性突變抗原（TSMA）作為T細胞排斥抗原的角色。研究進一步探索了基于這些突變表位的合成長肽（SLP）疫苗，在誘導腫瘤排斥方面的效果，以及其與檢查點阻斷免疫療法的比較。

研究方法

1. 實驗模型與腫瘤移植

實驗模型：研究使用了兩種不同的進行性MCA肉瘤細胞系（d42m1-T3和F244），并將這些細胞系移植到野生型（WT）小鼠體內。

治療與評估：小鼠接受αPD-1和/或αCTLA-4的治療，并評估腫瘤的生長和排斥情況。通過注射耗竭CD4+或CD8+細胞的抗體或中和IFN-γ的抗體來確認免疫排斥的機制。

2. MHC I類表位預測

基因突變分析：通過cDNA捕獲測序鑒定d42m1-T3細胞系中的非同義突變，并將這些突變轉化為相應的蛋白質序列。

表位預測算法：使用三種MHC I類表位結合算法（穩定矩陣法、人工神經網絡算法和NetMHCpan算法）預測表位加工和結合親和力，計算每個預測表位的中位結合親和力。表位篩選：應用過濾條件，包括去除預測加工不良的表位、來自假設蛋白的表位以及與其對應野生型序列相比結合親和力較低的表位。

3. 腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）的分析

四聚體染色：使用加載有預測突變表位的H-2K^b或H-2D^b四聚體染色新鮮分離的CD8+ TILs，以鑒定特異性T細胞。

細胞因子檢測：通過ELISPOT和細胞內細胞因子染色檢測IFN-γ和TNF-α的產生，以評估T細胞的活性。

4. 疫苗實驗

疫苗制備：合成包含突變表位的長肽（SLP），并與聚肌胞苷酸（poly I:C）一起作為疫苗。

疫苗接種：將疫苗注射到已建立腫瘤的小鼠體內，評估腫瘤排斥和生存情況。

5. RNA測序與基因表達分析

RNA提取與測序：從經過不同檢查點阻斷治療的小鼠的mLama4特異性CD8+ TILs中提取RNA，并進行RNA測序。

基因表達分析：使用DESeq2 R包分析差異表達的基因，并進行基因集富集分析（GSEA），以揭示不同治療途徑中受調節的通路。

研究結果

1. 檢查點阻斷免疫治療誘導腫瘤排斥

腫瘤排斥：d42m1-T3和F244肉瘤細胞系在接受αPD-1和/或αCTLA-4治療的野生型小鼠體內被排斥。排斥是免疫性的，因為它可以通過耗竭CD4+或CD8+細胞或中和IFN-γ來消除，并且在缺乏T、B和NKT細胞的Rag2-/-小鼠或缺乏CD8α+/CD103+樹突狀細胞的Batf3-/-小鼠中不發生。

免疫檢查點阻斷治療后，d42m1-T3的排斥需要先天和適應性免疫組分的參與：a. Rag2?/?、Batf3?/?或野生型小鼠隊列分別接受對照單克隆抗體（mAb）、αCD4、αCD8α或αIFN-γ單克隆抗體處理，隨后皮下注射1×10⁶個d42m1-T3腫瘤細胞，并在移植后第3、6和9天接受αCTLA-4治療。b、c. d42m1-T3（b）或F244（c）腫瘤細胞皮下注射到野生型小鼠（n=5）中，隨后在移植后第3、6和9天接受αPD-1治療。在腫瘤被排斥50天后，小鼠再次接受d42m1-T3或F244腫瘤細胞的挑戰。

2. 突變表位鑒定

表位預測與驗證：通過生物信息學方法預測了d42m1-T3細胞系中多個潛在的MHC I類結合表位，并通過四聚體染色和細胞因子檢測驗證了其中兩個主要的表位：mLama4和mAlg8。

質譜驗證：使用發現質譜（MS）和靶向選擇反應監測（SRM）MS方法在d42m1-T3腫瘤細胞的H-2K^b洗脫物中檢測到了mLama4和mAlg8表位。

3. 疫苗的有效性

腫瘤排斥與生存：與接受無關HPV長肽疫苗或僅接受poly I:C的小鼠相比，接種了包含mLama4和mAlg8表位的長肽疫苗的小鼠在建立腫瘤后顯示出顯著的腫瘤排斥和生存益處。

預防性疫苗接種：預防性接種mLama4和mAlg8長肽疫苗的小鼠在接種腫瘤細胞后顯示出更高的生存率。

4. 基因表達與通路分析

基因表達變化：不同檢查點阻斷治療對mLama4特異性CD8+ TILs的基因表達產生了大多治療特異性的改變，涉及CD8+ T細胞效應功能的不同基因集。

通路分析：GSEA揭示了不同治療途徑中受調節的通路，包括效應功能、MAPK、趨化因子和細胞因子受體信號通路以及代謝和IL-2信號通路等。

5. 功能表型的變化

制性受體表達：經過αPD-1和/或αCTLA-4治療的小鼠的mLama4或mAlg8特異性CD8+ TILs顯示出較低的淋巴細胞激活基因3（LAG-3）和T細胞免疫球蛋白和粘蛋白蛋白3（TIM-3）表達。

細胞因子產生：治療后的TILs顯示出增強的IFN-γ和TNF-α產生，特別是接受αCTLA-4或αCTLA-4+αPD-1組合治療的小鼠。

IFN-γ ELISPOT分析mLama4或malg8 SLP加polyI:C免疫小鼠的肽刺激脾細胞（每組n=3只小鼠）

在免疫檢查點阻斷研究期間，研究者多次使用mabtech IFN-γ ELISpot檢測來表征抗原特異性T細胞在接受抗CTLA-4治療前后的功能。根據種屬，板子類型，酶標物等因素的不同，mabtech可提供多種IFN-γ ELISpot試劑盒以滿足不同客戶的需求：