Jackson：抗羊駝 IgG VHH 二抗

VHH 抗體（納米抗體）

重鏈抗體

VHH 抗體（納米抗體）正迅速被應用于多個領域，包括醫學診斷、治療、生物傳感器、結晶伙伴和小分子檢測等。VHH抗體來源于駱駝重鏈免疫球蛋白（IgG亞類2和3）的VHH結構域。通過篩選駱駝科宿主動物（通常是羊駝或駱駝）的 VHH 文庫，獲得具有目標特異性的 VHH 序列，然后在選定的表達系統中生產重組 VHH（rVHH）。圖 1 所示的長 CDR（互補決定區）是 VHH 域的特征，使 VHH 抗體能夠進入常規抗體無法到達的抗原位點。

非典型免疫球蛋白

駱駝科動物（羊駝、駱駝等）除了常規的 IgG1 外，還產生兩種非典型的免疫球蛋白。IgG2 和 IgG3 被稱為重鏈免疫球蛋白。它們具有單域結合位點（VHH），不包含 CH1 域或輕鏈（圖 1）。

圖 1：常規 IgG、重鏈免疫球蛋白IgG和 VHH 域抗體。插圖：VHH 域抗體的空間填充和絲帶圖（PDB 1MEL），顯示 3 個 CDR 環，其中較長的 CDR3 環以橙色顯示。

VHH 抗體的優勢

-治療優勢：VHH 抗體能夠穿過血腦屏障并進入其他難以到達的部位，因此可用于藥物遞送。它們在血液中清除迅速，對人類相對無免疫原性。良好的穩定性使其可通過多種途徑遞送，包括靜脈注射、皮下注射、鼻吸入和口服。

-框架：12-15 kDa 的抗原結合 VHH 域作為重組抗體生產的框架。VHH 抗體可以設計成多種結構形式。

-靶向：VHH 抗體的小尺寸和長 CDR3 環使其比傳統抗體更容易接近隱蔽的表位。

-穩定性：VHH 抗體具有良好的溶解性，對熱、蛋白酶和極端 pH 值穩定。

-生產：VHH 抗體易于克隆和修飾。它們可以在細菌、酵母和哺乳動物表達系統中以高水平重組生產。其設計可以包括用于純化的標簽，或用于添加藥物或熒光探針的功能基團。

抗 VHH 抗體

Jackson 抗羊駝二抗旨在優化檢測源自駱駝科動物（羊駝和駱駝）的抗體。其開發了多種試劑，以促進通過多種技術識別 VHH 抗體，包括：

-酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

-免疫印跡（Western Blotting）

-流式細胞術（Flow Cytometry）

-免疫熒光（Immunofluorescence）

多克隆二抗的效用在于其能夠識別目標（一抗）免疫球蛋白上的多個表位。通過用羊駝的 VHH 片段（從純化的重鏈免疫球蛋白中獲得）免疫山羊，獲得抗 VHH 域抗體。我們已經證明，這些多克隆抗體能夠穩健地識別羊駝和駱駝 VHH。然而，一些重組 VHH 可能不會顯示許多存在于天然 VHH 片段上的抗原，這使得這些二抗難以檢測。

多功能檢測 VHH 抗體，不受物種或形式限制

重組納米抗體通常是從羊駝或駱駝重鏈抗體的 VHH 結構域框架中生成的。JIR 抗羊駝 VHH 結構域抗體旨在檢測駱駝科物種在天然和變性條件下的 VHH 框架。WB（圖 2）顯示，抗羊駝 VHH 在變性狀態下檢測到羊駝和駱駝的 VHH 框架。遷移的差異反映了 VHH 抗體結構的差異，特別是 VHH 二聚體 L4*。

如酶聯免疫吸附試驗（圖 3）所示，抗羊駝 VHH 抗體識別羊駝和駱駝 rVHH 的天然形式。不同 rVHH 構建體的信號強度不同，表明某些 rVHH 并未表達存在于免疫原（來自未免疫羊駝的 VHH 片段）上的表位。

圖 2：不同羊駝和駱駝 rVHH 域抗體的西方印跡。在還原條件下，純化的 rVHH（每孔 1μg）經 PAGE 電泳并轉移到硝酸纖維素膜上。用牛血清白蛋白（BSA，貨號 001-000-162）封閉印跡，并以 1:20K 稀釋的辣根過氧化物酶偶聯羊抗羊駝 VHH（128-035-232）進行探針檢測。使用 ECL 進行檢測。

圖 3：通過 ELISA 檢測來自羊駝或駱駝的 VHH 抗體。每種 rVHH 以 10 μg/ml 涂布于 ELISA 板，并用辣根過氧化物酶偶聯羊抗羊駝 VHH（128-035-230 或 128-035-232）和 TMB 底物進行檢測。

在大多數情況下，128-035-232 比 128-035-230 提供更強的信號，因為它對較少物種進行了交叉吸附。選擇抗體特異性時應考慮預期應用：如果物種交叉反應不是問題，則使用 128-035-232 以獲得更高的靈敏度。

間接檢測以增強信號

在 VHH 抗體與其靶標結合后，使用二抗進行檢測是標記導向檢測的替代方法。二抗提供信號增強和更多的偶聯選項。

免疫分析格式分析可以設置為多種形式，包括直接、間接、夾心和競爭。間接和夾心分析是更常用的格式。它們通過偶聯二抗增強來自目標分子的信號，從而提供更高水平的靈敏度。

圖4 A：通過 ELISA 檢測羊駝 rVHH 抗人 IgG 一抗。將純化的重組 GFP（rGFP）以 10 μg/ml 涂布于 ELISA 板。用牛血清白蛋白（BSA，貨號 001-000-162）封閉孔，并用幾種 rVHH 抗 GFP 一抗的連續稀釋液進行探針檢測。用辣根過氧化物酶偶聯羊抗羊駝 VHH（128-035-232）和 TMB 底物檢測一抗。

圖 4 B：顯示檢測羊駝 rVHH 抗 GFP 一抗的WB。兩種不同的純化 rGFP（每孔 0.5 μg）在還原條件下經 PAGE 電泳并轉移到硝酸纖維素膜上。用牛血清白蛋白（BSA，貨號 001-000-162）封閉印跡，并用 rVHH 抗 GFP 一抗進行探針檢測，然后用 1:10K 稀釋的辣根過氧化物酶偶聯羊抗羊駝 VHH（128-035-232）進行孵育。使用 ECL 進行檢測。

在生物樣本中檢測 VHH

VHH 開發的篩選階段以及下游應用可能需要檢測。與在 VHH 的 N 端或 C 端添加標簽相比，使用特定于 VHH 的二抗進行直接檢測在許多應用中具有優勢。例如，使用抗 VHH 域抗體可以避免通過 His6 等純化標簽進行檢測，減少與具有標簽表位同源性的內源性蛋白的背景信號。

在WB中，羊駝 VHH 抗體能夠在其他蛋白存在下特異性地檢測 rVHH。與抗 His6 抗體相比，羊駝 VHH 抗體在檢測細胞培養上清或細胞裂解液中的重組蛋白時顯示出顯著較少的非特異性檢測（圖 5）。在純化前篩選或定量 VHH 表達的能力加快了發現和生產進程。然而，VHH 相對于細胞裂解液中的總蛋白的量可能非常小，使得可靠表征變得困難。通過靶向 VHH 域，抗羊駝 IgG VHH 域抗體消除了猜測或標簽的需求。如圖 6 所示，這些多克隆抗體能夠在細胞裂解液中以高靈敏度和特異性檢測 VHH。

圖 5：比較大腸桿菌裂解液中目標蛋白檢測的WB。大腸桿菌裂解液蛋白在還原條件下經 PAGE 電泳并轉移到硝酸纖維素膜上。用牛血清白蛋白（BSA，貨號 001-000-162）封閉印跡，并以 1:5K 稀釋的辣根過氧化物酶偶聯抗 His6 抗體或辣根過氧化物酶偶聯羊抗羊駝 VHH（128-035-232）進行探針檢測。使用 ECL 進行檢測，并同時成像印跡。泳道 1：僅 20 μg 大腸桿菌提取物；泳道 2：含 rVHH 表達的大腸桿菌提取物（占總蛋白的 5%，即 1 μg）；泳道 3：含 rVHH 表達的大腸桿菌提取物（占總蛋白的 1%，即 0.2 μg）。

圖 6：顯示在大腸桿菌蛋白裂解液中檢測 rVHH 分析物的夾心 ELISA。將 AffiniPure? 羊抗羊駝 VHH（128-005-232）涂布于 ELISA 板作為捕獲抗體，隨后加入純化 rVHH 標準品或含 rVHH 分析物的大腸桿菌裂解液（占總蛋白的 1% 或 5%）。用辣根過氧化物酶偶聯羊抗羊駝 VHH（128-035-232）和 TMB 底物檢測 rVHH。

流式細胞術檢測 VHH

重組 VHH 構建體可能成為治療應用的候選者，因此需要在動物模型或患者中追蹤它們的存在。山羊抗羊駝 VHH 抗體（例如，Alexa Fluor 488 偶聯 128-545-230）可用于檢測患者細胞上的 VHH，而不會識別內源性 IgG 或源自小鼠、兔或大鼠的一抗。

目前的腫瘤學研究在多種 T 細胞重定向策略中采用 VHH 技術，以利用患者自身的免疫防御。這些策略包括生成雙特異性格式以招募和激活細胞毒性或 γδ T 細胞，設計基于納米抗體的嵌合抗原受體（CAR）T 細胞，以及開發免疫檢查點阻斷納米抗體。通過流式細胞術對修飾的 T 細胞進行表征，通常允許分選和擴增表達 CAR 的細胞。

圖 7：使用羊駝 VHH 抗人 IgG 和 Alexa Fluor 488 羊抗羊駝 VHH 間接檢測淋巴細胞上的人 IgG。

我們使用多克隆羊駝 VHH 抗人 IgG（而非 CAR）來展示 128-545-230 在流式細胞術中的效用。相鄰的圖代表在淋巴細胞上設置的樣本。羊抗羊駝 VHH 不識別小鼠抗 CD19，并且僅在存在 VHH 抗人 IgG 時檢測人 IgG。

使用 VHH 抗體進行成像

使用 VHH 抗體進行檢測需要熒光探針或酶等報告分子來可視化目標蛋白。偶聯的山羊抗羊駝 VHH 抗體提供了間接檢測的固有優勢，如信號增強和偶聯選擇。

抗羊駝 IgG 二抗

圖 8：HEp-2 細胞的 Ki-67 和微管雙重標記。HEp-2 細胞采用以下組合進行染色：兔抗 Ki-67，羊駝抗兔多克隆 VHH，以及 Alexa Fluor 488 偶聯山羊抗羊駝 IgG VHH 域（128-545-230）（綠色）；小鼠抗微管和 RRX 偶聯山羊抗小鼠 IgG（115-295-146）（紅色）。使用 DAPI 進行核染色（藍色）。

山羊抗羊駝 IgG VHH 域（最少牛、人、小鼠、兔和大鼠血清蛋白）已對常見宿主物種進行交叉吸附，以最小化背景和非靶標標記。

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