蛋白質印跡手冊之四：WB之蛋白分離

Western印跡可重點概括為三個步驟：1、在聚丙烯酰胺凝膠上分辨一個復雜的蛋白質樣品；2、將分辨好的蛋白質轉移到膜上；3、膜上特定蛋白質的鑒定。下面將重點為大家介紹了SDS-PAGE技術的操作要點和考慮因素。

Western印跡是否成功則必須滿足四個要求：

1、從凝膠上洗脫 – 在轉移過程中蛋白質必須從凝膠上洗脫。如果它仍保留在凝膠上，則無法開展印跡分析。

2、吸附到膜上 – 在轉移過程中蛋白質必須吸附到膜上。如果蛋白質不吸附，則無法開展印跡分析。

3、處理過程中的蛋白截留 – 在轉移后的印跡處理過程中，蛋白質必須仍然吸附在膜上。

1、處理過程中蛋白的可及性 – 吸附的蛋白質必須能與檢測它的化學試劑接觸。如果蛋白質被掩蔽，那它就無法被檢測。

Western印跡中所涉及操作的理論和實際考慮。

在1-D或2-D凝膠上分離復雜的蛋白質混合物。在印跡之前分離復雜蛋白質混合物的最常用方法是一維（1-D）十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），其中蛋白質是根據其分子量分離的（圖1）。在某些情況下，使用非變性條件來分離天然蛋白。盡管這種方法通常不及變性電泳的分辨率，但是在一抗只識別非變性蛋白或必須在膜上保留蛋白質的生物活性時，這特別有用。

二維（2-D）凝膠電泳是分析細胞類型、組織和體液中蛋白質組成的理想技術，也是蛋白質組學的核心技術。2-D凝膠的免疫印跡提供了分子量和等電點的信息，在區分翻譯后修飾所產生的蛋白質異構體上很有用（Celis和Gromov，2000）。在某些情況下，通過等電聚焦的一維分離后的免疫印跡可實現蛋白質分型（Poland等，2002；Eto等，1990）。二維印跡的例子如圖2所示。

分子量標準品

凝膠中包含分子量（MW）標準品，或marker，有助于在電泳分離后估計感興趣的蛋白質的大小。目前有兩種類型的標準品，未染和預染。未染的MW marker通常包含已純化的分子量已知的天然或重組蛋白。觀察它們在凝膠或膜上的定位需要借助一個染色步驟。

預染的MW marker如圖4所示。使用預染marker既有優點，也有缺點。預染marker可實現在電泳過程中監控凝膠上的蛋白質分離。它們也能指示后續轉印步驟中的轉移效率。然而，它們相對較貴，且染料的添加可能影響蛋白質遷移率。在確定分子量時，預染marker沒那么準確，因為蛋白質上結合的染料會改變印跡過程中它們吸附到膜上的能力。

圖1. 實現了電泳過程中蛋白質遷移的直接觀察以及任一Western印跡上準確的大小判定。

圖2. 通過二維電泳分離的蛋白質的化學發光檢測。大鼠成纖維細胞系的銀染2-D凝膠（左）和同一張凝膠的印跡（右），在轉印P膜上用小鼠單克隆抗體雜交，并通過化學發光法觀察。

聚丙烯酰胺的濃度

凝膠上聚丙烯酰胺的濃度可以是均勻的，也可以是梯度的。最常用的聚丙烯酰胺濃度，10%，最適合10-150 kDa范圍內蛋白質的分離。如果正在分析未知的蛋白質，或需要更廣泛的分離，建議使用梯度膠。例如，4-12%的Tris甘氨酸凝膠適合30至200 kDa范圍內的蛋白質，而10-20%的凝膠能成功分離6至150 kDa的蛋白質。SDS-PAGE凝膠的厚度通常為1.0和1.5 mm；不過，對于印跡而言，較薄凝膠（= 1 mm）的蛋白質轉移最好。

凝膠電泳緩沖液

最常用的凝膠電泳緩沖液是由Tris甘氨酸或Tris-tricine組成的。緩沖液中可能含有0.1%的去污劑，通常是SDS。Tris甘氨酸緩沖液系統適合分離分子量范圍廣（6-200 kDa）的蛋白質，并與變性或非變性條件兼容。Tris-tricine系統最適合分離較小的，需要在上樣之前還原和變性的蛋白質（<10 kDa）。兩種緩沖液系統都與蛋白轉移到PVDF膜上兼容。Tris醋酸緩沖液有時用于較大蛋白的分離。

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