《Nature》：揭示MapSPARTA的活化機理

Argonaute蛋白在進化過程中演變出了各種亞科蛋白。這些亞科蛋白可以識別各種不同類型的小RNA分子，從而在各種小RNA沉默途徑中發揮作用。在經典的由siRNA分子介導的RNAi途徑中，Argonaute蛋白可以用內切核酸酶活性來沉默mRNA靶分子，這種過程被稱作切割。在生殖細胞中，面對各種外來的遺傳物質，Argonaute亞科蛋白PIWI蛋白在piRNA介導的RNA沉默途徑中，利用的也是切割機制。

在真核生物Ago (eAgo)蛋白，Argonaute (Ago)蛋白可以結合非編碼的小RNA，參與降解或者抑制互補配對的靶向RNA，從而影響基因表達，稱之為RNA干擾 (RNAi)【2】。揭示RNA干擾機理的兩位美國科學家獲得了2006年的諾貝爾生理醫學獎。所有的eAgo都具有非常保守的結構功能域，主要由N-結構域（結合與分離靶向鏈），PAZ結構域（結合引導鏈的3’末端），MID結構域（結合引導鏈的5’末端）和PIWI結構域（核酸酶催化中心所在）組成。

細菌Ago（pAgo）蛋白主要分為長pAgo和短pAgo蛋白。其中，研究較多的長pAgo結構域和eAgo結構域非常相似，主要使用RNA或者DNA作為靶向序列參與清除入侵的核酸（噬菌體或質粒）或解除基因組連接。而占已知pAgo大多數的短pAgo的研究較少。短pAgo只編碼MID結構域和PIWI結構域，并且其PIWI結構域沒有核酸酶催化中心，不能降解結合的核酸。但是短pAgo通常與一個伴侶蛋白形成異源復合物發揮功能。長久以來，細菌中的短pAgo（約占Ago家族58%）如何發揮作用以及怎么發揮作用是領域內亟待解決的重大問題【3】。

這一領域的第一個突破性發現來自荷蘭瓦赫寧根大學的Daan C. Swarts團隊。2022年，他們研究了一種短pAgo與伴侶蛋白（TIR-APAZ）組成的異源二聚系統MapSPARTA。當細菌遭受外源質粒侵襲后，MapSPARTA被激活，在單鏈RNA引導下結合靶向單鏈DNA后，MapSPARTA可以形成四聚體，從而激活伴侶蛋白中的TIR結構域的NAD(P)+酶活性，進而消耗細菌體內的NAD(P)+。因為NADP是維持細菌生存必需的小分子，NADP的耗竭將會導致細菌死亡。這樣，通過犧牲侵染細菌個體達到保護群體的效果【4】。Swarts團隊的發現未能揭示MapSPARTA的結構和活化機理。

2023年7月26日，來自俄亥俄州立大學的傅天民團隊，在Nature以加速出版形式發表論文Oligomerization-mediated activation of a short prokaryotic Argonaute，他們利用冷凍電鏡和生物化學手段，完整揭示了的MapSPARTA活化機理。

在文中，作者捕捉到一系列高分辨率的MapSPARTA構象，包括未激活狀態下的MapSPARTA單體結構，結合引導RNA鏈和靶向DNA鏈后的單體結構，MapSPARTA二聚化的中間態結構，四聚化的活化態的MapSPARTA，以及四聚體與NAD+的復合物，完整呈現了MapSPARTA獨特的層級激活分子機制。鑒于Ago蛋白在眾多生物體中的廣泛存在，研究清楚MapSPARTA的作用機制，不僅有助于理解短pAgo的生物學功能和分子作用機制，也為改造pAgo奠定了基礎。具體研究內容如下：

1)解析了分辨率為3.1 ?的未激活狀態下的MapSPARTA單體結構，闡明了單體的基本結構組成，以及各個結構域的相互作用。

2)與其他Ago相比，MapSPARTA獨特的APAZ結構域有一個C末端基序，這個C末端基序占據核酸結合口袋，起到抑制了核酸結合的功能。

3)闡明了MapSPARTA識別RNA引導鏈和DNA靶向鏈的分子基礎。與其他Ago相比，短的pAgoMID結構域中特別存在的兩個Loop，導致RNA引導鏈和DNA靶向鏈從第三位才開始互補配對。

4)解析了分辨率為2.7 ?的活化狀態下的四聚體MapSPARTA結構，結構像一個美麗的蝴蝶。四聚體中存在兩類相互作用：一類通過兩個MID-MID結構域介導；另一類則是通過4個TIR結構域形成聚集體來實現的。四個MapSPARTA形成一個不對稱的四聚體。四個SPARTA分子有兩種不同的狀態，兩種狀態下的TIR結構域有大約180度的翻轉。

5)TIR四聚體中有兩種相互作用界面：二聚化作用界面和四聚化作用界面。TIR結構域可以催化NAD降解，研究表明NAD+分子結合在TIR結構域兩個二聚化作用界面上。進一步生化分析發現四聚體對于TIR的催化是必要的。

6)本文捕捉到了MapSPARTA未激活結構，結合核酸的單體結構，結合核酸的二聚體結構， 以及活化的四聚體結構，這一系列結構揭示了MapSPARTA的層級激活機理。未激活狀態下的MapSPARTA單體結合RNA引導鏈/DNA靶向鏈后，MID結構域發生構象變化。接著，兩個結合互補核酸鏈的MapSPARTA單體相互靠近后，由于MID形狀和電荷的互補，MID結構域和另一個MID結構域發生相互作用，形成一個對稱的二聚體。在對稱二聚體中，APAZ連接的TIR結構域由于電荷和形狀的互斥反應，其中一個TIR結構域發生近約180度的翻轉，形成不對稱二聚體。最后兩個不對稱二聚化的MapSPARTA再通過TIR相互作用變為四聚化激活狀態。

圖1. MapSPARTA的圖示激活過程

綜上，本研究首次從分子水平上描述了短pAgo家族MapSPARTA的激活機制，為理解其他短Ago活化機理奠定了基礎，也為進一步改造MapSPARTA成為核酸檢測或治療工具提供了理論支持。

原文鏈接：

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06456-z

參考文獻：

1.Swarts, D. C. et al. The evolutionary journey of Argonaute proteins. Nat Struct Mol Biol 21, 743-753, doi:10.1038/nsmb.2879 (2014).

2.Peters, L. & Meister, G. Argonaute proteins: mediators of RNA silencing. Mol Cell 26, 611-623, doi:10.1016/j.molcel.2007.05.001 (2007).

3.Lisitskaya, L., Aravin, A. A. & Kulbachinskiy, A. DNA interference and beyond: structure and functions of prokaryotic Argonaute proteins. Nat Commun 9, 5165, doi:10.1038/s41467-018-07449-7 (2018).

4.Koopal, B. et al. Short prokaryotic Argonaute systems trigger cell death upon detection of invading DNA. Cell 185, 1471-1486 e1419, doi:10.1016/j.cell.2022.03.012 (2022).