蛋白質印跡—電泳

電泳可以是單相的（即一維分離）也可以是雙相的。單相電泳常用來進行蛋白和核酸的分離，蛋白的雙相電泳用于指紋-識別（即總蛋白成分分析）和細胞里所有蛋白的精確定位。

這里我們所描述的是單相電泳技術。我們推薦《Gel Electrophoresis of Proteins: A Practical Approach》（第三版，B. D.Hames 和 D. Rickwood 主編，實用方法系列，牛津大學出版社，1998年）這本書作為理解雙相電泳的參考。

PAGE 凝膠的制備

聚丙烯酰胺凝膠電泳，英文簡稱是 SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel Electrophoresis)，是根據蛋白質分子量來分離 蛋白質的基本方法。

聚丙烯酰胺凝膠由兩種復合物混合而成，丙烯酰胺和 N,N-亞甲基丙烯酰胺（簡稱bis）。Bis 是凝膠的交聯劑。通過加入過硫酸銨和 DMAP 或 TEMED 啟動交聯聚合作用。凝膠是中性，水溶性三維網狀結構（通過亞甲基交聯的碳氫化合物）。

凝膠對分子的分離取決于凝膠所形成的孔徑大小。凝膠孔徑的大小由兩個因素決定：丙烯酰胺的總量（%T）和交聯的數量（%C），當丙烯 酰胺的比例升高，孔徑降低。5% C 時孔徑最小。C% 增加或減少，孔徑也隨之增大或減少。凝膠以百分比進行設計，并且有二個重要的參 數?？偙０分傅氖潜０芳由蟗is丙烯酰胺所占的百分比(w/v)。例如，7.5% T 表示 100ml 凝膠中有 7.5 g丙烯酰胺和 bis。

凝膠可以商業購買或在實驗室自己制備。膠凝體的百分比對蛋白質遷移率和分離度至關重要。

拇指原則：目標蛋白分子量越小，mono/bis百分比越高；目標蛋白分子量越大，mono/bis的百分比越低。

丙烯酰胺是潛在的有累積作用的神經毒素：操作時要一直佩戴手套。

按照廠家說明將凝膠放在電泳槽中并且浸泡在電泳緩沖液中。

陽性對照

陽性對照裂解物用來表明試驗是有效的并且是正確的，及可證明目標蛋白不在樣本中表達。

當設定一個新實驗時，我們強烈推薦使用陽性對照裂解物，這將提高試驗的可信度。

分子量標準

跑在樣品旁邊的分子量標準能測定蛋白分子量的大小并且能監測電泳的進展。市面上有許多分子量標準可供選擇。

分子量標準：

貨號 ab48854 (MW 70, 57, 40, 28, 18, 13.5 and 8.5 kDa)

貨號 ab115832, Prism Protein Ladder (10-175 kDa)

貨號 ab116027, Prism Ultra Protein Ladder (10-180 kDa)

貨號 ab116028, Prism Ultra Protein Ladder (10-245 kDa)

貨號 ab116029, Prism Ultra Protein Ladder (3.5-245 kDa)

上樣和跑凝膠

使用特定的凝膠上樣吸頭或微型注射器在狹窄的樣品池中加入全部樣品，注意不要用尖頭刺破池的底部，否則會形成扭曲的條帶。

不要過度填充樣品池，如果樣品溢入旁邊的樣品池，將會影響結果。 每個樣品池裝載 20-40μg 蛋白。

將凝膠浸泡在電泳緩沖液中，這些緩沖液通常包含 SDS，天然的凝膠電泳除外。

一個標準的 PAGE 電泳緩沖液，又叫運行（running）緩沖液，是1×氨基乙酸-甘氨酸（參見第 71 頁的緩沖液章節）。

跑凝膠時按照廠家推薦的時間進行，這些可以隨著儀器的改變而變更（根據電壓，1 小時至過夜）。

當染料分子（“遷移前沿”）到達凝膠的底部，關閉電源。此時蛋白會從凝膠上慢慢的洗脫，因此不要保存在凝膠里，要迅速進行下一步的 轉移操作。

內參的使用

內參是用來檢測凝膠中的泳道是否載有相同的上樣量。在比較不同樣品的蛋白表達水平時這一點尤其重要。這對檢查整個凝膠的平均轉膜亦 十分重要。如有上樣或轉膜不平均的情況，內參對照可用來定量每條泳道的蛋白量。對于準備發表出版的試驗，加入對照是絕對必需的。