大盤點：彗星實驗(單細胞凝膠電泳)疑難雜癥

【前情回顧】彗星分析怎么做？專業彗星分析試劑盒一站式解決方案

【前情回顧】Comet Assay Kits 彗星分析試劑盒說明書（以STA-350，3孔板為例）

我們都知道彗星實驗（comet assay）的別名也叫單細胞凝膠電泳試驗（single cell gel electrophoresis，SCGE）,是用來有效評估DNA損傷的一種檢測方法，或許它的檢測原理你已經熟記于心了，但是它究竟有哪些應用，實驗過程中常見問題有哪些，不同問題又要怎么處理。。。。。。看到這里是不是有些凌亂了，今天我們就來一鍋燴了它！

原理：器官或組織經處理（化學或物理因素，如輻射、重金屬等）后，細胞中的DNA發生單鏈或雙鏈斷裂，經細胞及其核膜裂解后，DNA解旋，在電場作用下，DNA 斷片遷移出細胞核，形成彗星狀的電泳圖譜。正常細胞的大分子DNA在電場作用下遷移距離較短，DNA仍保留在細胞核的范圍，形成圓形或輕微拖尾的圖譜。DNA損傷愈大，DNA碎段就愈多，愈小的DNA碎段游離的速度就愈快，也游離愈遠，因而形成了彗星的尾部，而較大的一些碎段位置則靠近細胞核，因而形成彗星的頭部。DNA碎段的游動的程度不同，使它呈現出彗星狀，彗星的長度（從細胞核到彗星尾端的距離）與DNA的損害程度有關，彗星尾端愈長，細胞的損害程度愈大。

應用：DNA損傷是指由化學或物理因素引起的DNA鏈斷裂、分子基體修飾和DNA交聯等。如果這種損傷沒有得到及時修復，就會引起突變，乃至癌變。彗星實驗從一種在單細胞水平上檢驗DNA鏈損傷的靈敏方法，可以用來判別某種物質是否是致癌物，并衡量其對人體DNA修補的影響程度。目前彗星實驗已經逐步成為篩選致癌和致突變遺傳毒性物質、監測環境介質中的遺傳毒性物質和研究化合物致癌作用機理的重要方法，在風險評價，尤其是在土壤和水環境污染潛在生態風險和致癌健康風險的研究方面也取得了很多重要的研究成果。由于DNA損傷關系到生物個體遺傳信息的表達，與種群密度和生態群落影響很可能存在直接或和間接聯系，因此該效應標記方法將不僅僅是從生物個體角度起到環境預警的作用，從區域管理的角度也可能作為反映生態和健康效應的重要指標。另外，鑒于彗星實驗對于真核細胞的普遍適用性，也為目前致癌物環境毒理組學研究和致癌風險評價體系提供了重要的手段。

傳統的彗星分析方法步驟繁瑣，需要單獨配置裂解試劑，需要提前對樣品DNA進行處理，且每次檢測樣品有限，染色過程中需要EB等致癌染料。Cell Biolabs的OxiSelect? Comet Assays (Single Cell Gel Electrophoresis)克服了上述障礙，可以一次進行多個樣品的處理，解決了由于處理時間不同而導致的實驗結果差異。而且OxiSelect? Comet Assays (Single Cell Gel Electrophoresis)試劑盒可提供多種樣式供您選擇，有3孔板（貨號：STA-350/351/351-5）和96孔板不同樣式。其中OxiSelect? Comet Assay Kit中，包含彗星分析載玻片、彗星分析用瓊脂糖以及其它試劑；另外Cell Biolabs根據您的實驗要求，還單獨提供彗星分析載玻片，也根據3孔板樣式和96孔板樣式分為多種樣式。

彗星實驗試劑盒信息：

彗星實驗試劑盒內特殊處理電泳載玻片：

除了操作簡便，OxiSelect^TMComet Assay Kit還有以下優點：

1）適用于各種DNA損傷檢測，是一款非常好用的DNA損傷檢測篩選工具；

2）試劑盒中的載玻片經過特殊處理以粘附低熔點瓊脂糖，避免“脫膠”問題出現；

3）采用特殊的DNA熒光染料，能有效降低背景干擾，更加方便讀取實驗結果。

常見問題：

Q1: 彗星分析試劑盒可以檢測什么類型的損傷？

A1: 彗星分析試劑盒檢測結果提供了DNA損傷的全局圖，可以檢測DNA雙鏈斷裂，單鏈斷裂和AP位點引起的損傷變化。根據電泳緩沖液的pH值不同，可分為中性彗星實驗（pH=8.4）和堿性彗星實驗（pH＞13）。中性彗星實驗主要用于檢測DNA單鏈、雙鏈以及一部分AP位點的斷裂損傷，堿性彗星實驗具有更高的靈敏性，可用于檢測更少量的單鏈和雙鏈斷裂損傷,以及大部分AP位點和堿不穩定的DNA加合物。

Q2: 彗星玻片可以重復使用嗎?(這個是最近問得最多的一個問題)

A2：不能。Comet載玻片表面經過了特殊處理，一旦整個載玻片經歷了變性，電泳和洗滌的操作步驟，就不能再重復使用了。

Q3：我可以用常規載玻片代替Comet載玻片嗎？

A3：不能，Comet載玻片已經過化學預處理，以增加附著力。 如果采用常規載玻片的話，您的細胞/瓊脂糖液滴將無法停留在載玻片上。

Q4：陽性對照怎么設置？

A4：用20uM依托泊苷(etoposide)處理細胞4小時，以形成彗星尾巴作為陽性對照。

Q5：用Vista Green染料染色后的玻片可以保存多久？

A5： 用Vista Green染色后的玻片可在4?C的黑暗環境中保存3個月，熒光也不褪色。 干燥且未沾有Vista Green的載玻片可以保存一年。

Q6：哪種電泳儀適合該彗星分析試劑盒？

A6：彗星分析試劑盒可用于任何水平電泳槽，不限于任何特定型號，但不能與垂直電泳儀一起使用。

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