Comet Assay Kits 彗星分析試劑盒說明書

艾美捷科技，Cell Biolabs中國區總代理  

*為方便客戶使用試劑盒，艾美捷科技善意將其翻譯成中文操作手冊，請以試劑盒中配套的英文版為準。因編者翻譯水平有限，對于由本說明書中不當翻譯所造成的損失，概不負責，如有錯誤，歡迎指正！

本說明書對應英文鏈接：https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA-350-comet-assay-kit.pdf

實驗開始前，建議先通讀說明書（請以試劑盒中配套的英文版為準）：

      介紹：由于環境因素和細胞內正常的新陳代謝過程，DNA損傷每天以每個細胞1000到100萬個分子損傷的速度發生。雖然這只占人類基因組約60億個堿基(30億個堿基對)的一小部分，但關鍵基因的未修復損傷可能會阻礙細胞發揮其功能的能力，并顯著增加癌癥的可能性。彗星實驗（Comet assay）也被稱為單細胞凝膠電泳實驗（Single cell gel electrophoresis，SCGE），是一種超靈敏的單細胞水平上檢測DNA損傷的技術。在電泳場下，損傷的細胞DNA(包含碎片和鏈斷裂)從完整的DNA中分離出來，在顯微鏡下形成典型的“彗星尾巴”形狀。DNA損傷的程度通常是通過測量彗星尾巴來目測的，也可以使用圖像分析軟件來測量各種參數。

OxiSelect™ Comet Assay是一種快速、靈敏的，用于測量細胞DNA損傷的試劑盒。每個試劑盒提供足夠的試劑，最多可進行15次檢測。

OxiSelect™ Comet Assay實驗原理：Cell Biolabs 的 OxiSelect™ Comet Assay 是一種單細胞凝膠電泳法 (SCGE)，用于簡單評估細胞 DNA 損傷。首先，將單個細胞與低熔點瓊脂混合后，再應用到OxiSelect™ Comet特制玻片上。然后，用裂解緩沖液和堿性溶液處理這些嵌入的細胞，使DNA松弛并變性。最后，在電泳槽中對進行電泳，以分離完整的DNA和受損的片段。電泳后，樣品被干燥，用DNA染料染色，并通過外顯熒光顯微鏡可視化。在這些條件下，受損的DNA（包含裂解和鏈斷裂）將比完整的DNA遷移更多，并產生 "彗星尾 "形狀（見圖1）。

圖1，彗星實驗原理與流程示意圖

客戶自備材料：

1.氯化鈉粉末

2.NaOH顆粒

3.10 N NaOH，用于調整pH值 （10 N NaOH = 10 M NaOH =10 mol/L NaOH）

4.DMSO（可選）

5.70%乙醇

6.TE緩沖液（10mM Tris，pH 7.5，1mM EDTA）。

7.PBS（不含Mg2+和Ca2+）。

8.EDTA(二鈉鹽)

9.DI H2O（去離子水）

10.37ºC和沸水浴

11.水平電泳槽

12.可調節的單通道微量移液器，帶一次性吸頭。

13.帶FITC過濾器的外顯熒光顯微鏡

保存條件：收到試劑盒后，將綠色熒光DNA染料，10000X存放在-20ºC。 所有其他試劑盒組件在室溫下儲存。

一、試劑準備：

1.OxiSelect™ CometAgarose：將Comet Agarose瓶放在90-95ºC水浴中加熱20分鐘，或者直到瓊脂膠液化。將瓶子轉移到37℃的水浴中20分鐘，并保持直到使用。

2.1X Vista Green DNA Dye工作液:使用TE緩沖液（10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA）稀釋原10000X的Vista Green DNA Dye母液，按照1:10000的比例，稀釋成1X的Vista Green DNA Dye工作液。1X工作液可在4℃避光條件下保存3周。

3.Lysis Buffer: 準備100ml的1X 裂解緩沖液

* 血紅素在4℃成膠狀，用DMSO溶解的血紅素。DMSO的添加是任選的，僅對含有血紅素的樣品（例如血細胞或組織樣品）是必需的。加入DMSO對實驗結果沒有影響。

4.Alkaline Solution：準備100ml的堿性溶液

5.Electrophoresis Running Solution: 準備1L電泳緩沖液，需求選擇電泳模式（二選一）：

* 實驗過程中的各類緩沖液都需要4℃預冷。

5.1 TBE Electrophoresis Solution （中性）

或者5.2 Alkaline Electrophoresis Solution (300 mM NaOH, pH >13, 1 mM EDTA)（堿性）

特殊說明：為避免紫外線對細胞樣品造成額外損害，請在弱光條件下進行實驗。

二、準備樣品和玻片：

1.準備裂解緩沖液、堿性溶液和電泳緩沖液（見試劑準備），然后再進行實驗。將所有溶液徹底冷卻至4ºC。

2.將OxiSelect™ Comet Agarose放在90-95ºC水浴中加熱20分鐘，或者直到瓊脂膠液化。將瓶子轉移到37℃的水浴中20分鐘進行冷卻，并保持直到使用。

3.在OxiSelect™ Comet玻片上，每孔加入75 ul 37℃的Comet Agarose，形成基層膠。用移液器將膠溶液涂抹在孔上，確保完全覆蓋和平鋪。將載玻片轉移到4ºC下水平放置15分鐘，使其固化。

4.按照如下方式準備細胞樣品，與對照細胞：

懸浮細胞：以700×g離心2mins，棄上清，用冰冷的PBS（無Mg2+和Ca2+）洗滌細胞一次，離心，棄上清。最后，用預冷4℃的PBS（無Mg2 +和Ca 2 +）重懸細胞到1×10⁵個細胞/ml 。

貼壁細胞：輕輕地從細胞培養瓶/培養皿中取出細胞，用橡膠細胞刮處理。將細胞懸浮液轉移到錐形管（EP）中，并在700×g離心2mins，棄上清。用冰冷的PBS（不含Mg2+和Ca2+）洗滌細胞一次，離心，并丟棄上清液。最后，用預冷4℃的PBS（無Mg2 +和Ca 2 +）重懸細胞到1×10⁵個細胞/ml 。

組織樣品：使用解剖剪刀，切碎一小塊組織到1-2ml冰冷的含20mM EDTA的PBS緩沖液（無Mg2 +和Ca 2 +）。組織/細胞懸浮液放置5分鐘，然后將上清液轉移到離心管中，避免轉移碎片。700×g離心2mins，丟棄上清液。最后，用預冷4℃的PBS（無Mg2 +和Ca 2 +）重懸細胞到1×10⁵個細胞/ml 。

* 推薦陽性對照：使用20 uM Etoposide（依托泊苷）處理4小時。

5.將細胞懸液與Comet Agarose（步驟2）以1:10的比例（v/v），用移液槍混合均勻，并立即轉移75ul 到每個孔中的原基層膠上方（步驟3）。確保完全覆蓋平鋪孔板，非常輕柔和小心地用移液管尖傳播的懸浮液，而不干擾基層膠。

Note: 對于多個樣品的處理，將細胞與Comet Agarose混合液保持在37℃，避免凝膠化。準備好樣品后，重新混勻，依次取出75ul加入到玻片孔中。

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