ELISA 樣品制備

進行 ELISA 前制備樣品的提示

請參閱隨試劑盒提供的實驗方案，了解有關樣品制備和相容性樣品類型的產品特定詳細信息。

這些指南旨在作為教育資源用于制備 ELISA 測定法中用到的常規試樣。根據靶標和需要檢測內容的不同，樣品的制備過程可以進行優化。當構建新的測定法時，查閱相關文獻獲得與您實驗類似的實驗實例通常是較好的做法。

樣品制備方法

細胞培養物上清液

—將細胞培養基移至離心管，并在 4°C 下以 1,500 rpm 離心 10 分鐘。

—立即分裝上清液并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。

細胞提取物

—將組織培養板放置在冰上。

—吸出培養基并且用冰冷的 PBS 輕輕洗滌細胞一次。

—吸出 PBS 并且每 100 mm 培養板添加 0.5 mL 完全提取緩沖液。

—剝離細胞，收集在傾斜板中，然后移至預冷管中。

—短暫渦旋并在冰上孵育 15-30 分鐘?！?4°C 下以 13,000 rpm 離心 10 分鐘，沉淀不溶性內容物。

—將上清液（這里是指可溶性細胞提取物）分裝至冰上干凈的冷卻管，然后在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。

條件培養基

—將細胞接種到完全（含血清）生長培養基中，使細胞增殖到所需覆蓋度。

—棄去生長培養基并用幾毫升溫熱 PBS 小心洗滌。重復洗滌步驟。

—棄去最后的 PBS 洗滌液并小心添加無血清生長培養基。

—孵育 1-2 天?！獙⑴囵B基移至離心管，并在 4°C 下以 1,500 rpm 離心 10 分鐘。

—立即分裝上清液并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。

乳汁

—收集樣品并在 4°C 下以 10,000 x g 離心 2 分鐘。

—分裝上清液并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。血漿—將全血收集到含抗凝血劑的管中或添加 0.1 M 檸檬酸鈉至 1/10 終體積。

—在 4°C 下以 3,000 rpm 離心 10 分鐘。

—立即分裝上清液（血漿）并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。

尿液

—收集樣品并在 4°C 下以 10,000 x g 離心 2 分鐘。

—分裝上清液并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。

唾液

—收集樣品并在 4°C 下以 10,000 x g 離心 2 分鐘。

—分裝上清液并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。

血清

—將全血收集到未經處理的試管中，比如是不含抗凝血劑的試管。

—在室溫下靜止孵育 20 分鐘。

—在 4°C 下以 3,000 rpm 離心 10 分鐘。

—立即分裝上清液（血清）并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。

組織提取物

—用干凈的工具切割所關注的組織，最好在冰上進行，并應盡可能快以防止被蛋白酶降解。

—將組織置于圓底的微量離心管中，并浸入液氮中進行速凍。將樣品保存在 -80°C 下以便后續使用或放置在冰上進行直接勻漿。

—對于約 5 mg 的一片組織，需要向管中添加約 300 μL 完全提取緩沖液（查看細胞/組織提取緩沖液配方），然后用電動勻漿器勻漿?！逑吹镀瑑纱?，每次清洗使用 300 μL 完全提取緩沖液，然后在 4°C 下維持恒定振動 2 小時（例如置于冷室中的回旋搖床上）。

—在 4°C 下以 13,000 rpm 離心 20 分鐘。置于冰上，將上清液（這里是指可溶的蛋白質提取物）分裝至新的冷卻管中并在 -80°C 下保存樣品。盡可能減少凍融循環次數。

裂解緩沖液的體積必須根據存在的組織數量確定。最終蛋白質提取物的典型濃度 > 1 mg/mL。

細胞/組織提取緩沖液配方 

–100 mM Tris，pH 7.4 

–150 mM NaCl 

–1 mM EGTA 

–1 mM EDTA 

–1% Triton X-100 

–0.5% 脫氧膽酸鈉

制備完全提取緩沖液所需的其它試劑。

—磷酸酶抑制劑混合物—蛋白酶抑制劑混合物 

–PMSF

在使用前才根據生產商的說明來添加磷酸酶和蛋白酶抑制劑的混合物到細胞提取緩沖液里面，PMSF 的終濃度為 1mM。

一般建議

—推薦的蛋白質提取物濃度為至少 1-2 mg/mL。

—通常，用結合緩沖液將血清、血漿、細胞和組織提取物稀釋 50%。

—在融化后使用前，將樣品在 4°C 下以 10,000 rpm 離心 5 分鐘以除去任何沉淀物。