感受態細胞的制備

1.挑取適當菌株的 E.coli 單菌落接種于 2ml SOB 培養液中，37℃搖床過夜。

2. 取 0.5-1ml 過夜培養的菌液轉種到 50ml SOB 中，18℃劇烈震蕩，直到 A600達到 0.6。

3. 將培養物轉移到 50ml 離心管中，4℃ 4,000rpm/min 離心 10min。同時在冰浴上配置 TB 溶液。

4. 棄上清，將離心管倒置于濾紙上，使培養液被吸干。

5. 取 1ml 剛配的 TB 溶液打散菌體沉淀，再加入 15ml TB（1/3 體積的起始培養液），冰浴 10-15min，4℃ 4,000rpm/min 離心 10min。

6. 棄上清，沉淀重懸于 4ml TB（1/12.5 體積的起始培養液），冰浴 10min。

7. 加入 280ul DMSO，緩緩滴入并輕輕搖晃，使其充分混合均勻，冰浴 10min。

8. 將菌液分裝于 EP 管中，-80℃或液氮凍存。

9. 取兩管感受態細胞分別加入 1μl無菌 ddH2O（陰性對照）和 1μl純質粒（陽性對照）進行轉化（見后），以檢測感受態的質量。陰性對照平板上應該無菌落生長，陽性對照平板上菌落數目的多少顯示感受態效率的高低。

0.1MK-Pipes(pH6.7)的配制

稱取 3.02g Pipes 粉末溶于 80ml dd H2O 中，此時粉末不能完全溶解，用 10NKOH 或 KOH 固體調節 PH 值，只有當 PH 接近 6.7 時粉末才能完全溶解，此時當小心少量地加入 KOH 直至達到所需 PH 值。