病毒中RNA提取純化方法大全（試劑盒來助力）

在上一篇文章中，我們對SARS-CoV-2（新冠病毒）的結構和研究流程有了更深入的認識，闡明 了對SARS-CoV-2 生命周期動態的持續研究，有助于對病毒的診斷，同時對疫苗的的設計和開發至關重要。無論您是從細胞、組織還是病毒樣本開始，高效的RNA分離通常是成功實驗的第一步。這部分工作流程至關重要，因為足夠的純度和產量是確保下游應用順利和準確運行的基本要求。特別是對病毒而言，其低豐度和高污染性的特點，使得要確保不含宿主衍生的雜質污染的高純度的輸入原料更加困難，因此，對于病毒RNA提取顯得十分關鍵。這里小艾為大家整理了了10種常見的核酸純化方法，重點是病毒RNA的分離。

一、過濾

膜過濾是一種物理分離技術，根據膜的性質（例如，孔隙率）和液體含量（例如，粒度），液體的內含物通過或被膜排除。通過選擇具有適當孔徑的膜，可以過濾液體病毒樣本以排除細胞和其他大型非病毒污染物。

二、核酸酶處理

衣殼和包膜為病毒基因組提供了額外的保護層，防止核酸酶降解。DNAse和RNAse通常用于消除外源核酸，同時受保護的病毒基因組保持完整。

三、苯酚/氯仿抽提

可以使用苯酚/氯仿提取方法從病毒RNA基因組中分離宿主來源的基因組DNA和小RNA，該方法涉及將DNA 和RNA分別分為有機相和水相。首先，通過向含有核酸的樣品中加入酸性苯酚和酸性緩沖液來產生單相溶液。氯仿的加入創建了一個雙相系統，其中DNA和蛋白質分配到下層有機相，而上層水相保留RNA。水相可以另外用異丙醇處理，并通過基于硅膠柱的純化處理，以提取總 RNA 或單個小RNA（miRNA、tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA）和大RNA（mRNA、18SrRNA、28SrRNA） , snRNA) 分子，這取決于乙醇的濃度。

四、離心

低速離心：（例如，4℃下6000 ×g10分鐘)是一種簡單方便的病毒凈化方式。細胞和大的細胞碎片被沉淀，上清液中懸浮的病毒粒子可以進行更嚴格的純化。

超速離心：病毒的大小和密度不同于細胞器（例如線粒體、核糖體、細胞核）、生物大分子（例如 DNA、RNA、蛋白質）和污染病毒樣本的其他宿主成分。超速離心利用這些物理化學特性將病毒與非病毒元素分離。這種分離通常是通過結合蔗糖和氯化銫密度梯度來實現的。在超速離心之前，細胞碎片在初始離心步驟中被清除。通過首先應用蔗糖密度梯度離心進一步去除剩余的雜質，該離心基于顆粒的 S 值或沉降系數進行分離。然后將氯化銫密度梯度平衡離心（根據其浮力密度分離顆粒）應用于所得病毒粗級分，以獲得純化的病毒片段。

五、沉淀

儲存或下游應用（如感染和病毒基因組分離）通常需要濃縮的病毒制備物。已經開發出沉淀方法，以根據在無機鹽或聚醚化合物（例如硫酸銨、PEG-6000）溶液中的溶解度，快速、輕松且廉價地濃縮病毒并去除雜質。例如，據報道，在40%的飽和度水平下，硫酸銨會從補充有 10% FCS 的細胞培養基中誘導病毒沉淀，其中大部分(85%) 的蛋白質保持溶解狀態。

六、柱層析

有多種色譜樹脂（例如，蛋白A、陰離子交換、陽離子交換）可用，取決于色譜操作參數（例如，樹脂類型；緩沖液組成和 pH值等），可用于將病毒與宿主分離核酸、蛋白質等。然而，這些方法需要昂貴的儀器、復雜的協議、專業的技術知識和訓練有素的操作人員。

七、VIDISCA

基于cDNA擴增限制性片段長度多態性技術的病毒發現方法，或簡稱VIDISCA，允許優先擴增病毒核酸。血漿/血清和培養物上清輸入樣品已使用該方法成功測試。在典型的VIDISCA 方案中，病毒核酸首先通過離心和DNase處理選擇性富集，以消除細胞、線粒體及其相關的遺傳內容。然后提取封裝的病毒基因組。對于冠狀病毒等單鏈RNA病毒，需要使用隨機六聚體引物進行逆轉錄步驟，然后是互補DNA的第二鏈合成。得到的雙鏈DNA (dsDNA) 通過苯酚/氯仿抽提和乙醇沉淀進行純化。純化的dsDNA隨后用限制酶處理，這些酶消化幾乎所有病毒中存在的短識別序列。

大約80%的細胞總 RNA 是核糖體(rRNA)，宿主來源的RNA構成了人類血漿樣本中的大部分 RNA。因此，對VIDISCA協議進行了修改，加入了選擇性rRNA消耗，以提高檢測靈敏度和特異性。rRNA逆轉錄阻斷寡核苷酸以及不能與rRNA退火的非隨機六聚體的使用已被證明可以抑制非病毒cDNA合成并減少背景擴增。

八、用rRNA特異性DNA“剪刀探針”

選擇性去除rRNA核糖體RNA污染也可以用rRNA雜交寡核苷酸探針和伴隨的核酸酶介導的雜交消化。這些合成探針旨在補充特定的rRNA序列。RNase H處理導致rRNA/DNA雙鏈體中rRNA的靶向切割，而DNase I用于去除殘留探針。然后可以對去除了rRNA 的樣品進行下游純化。在適當的反應條件下，rRNA被特異性切割，同時保留了非雜交RNA 的完整性。

九、使用體外細胞培養物擴增病毒

鑒于病毒通常產生的滴度低，體外細胞培養物用于將病毒粒子擴增至分析相關的量。接種的 Vero和HEK293T細胞已有效用于病毒擴增目的。該方法包括在接種后24小時更換培養基，然后在另一個24小時孵育后從上清液中收集受感染細胞釋放的病毒粒子。

十、商業病毒 RNA 提取試劑盒

基于柱和磁珠的方法為從臨床標本中提取病毒 RNA 基因組提供了一種快速方便的方法。Epigentek提供各種用于分離RNA的磁珠和離心柱試劑盒來自不同樣本來源（細胞、組織、全血、唾液、鼻咽拭子）和物種（病毒、哺乳動物、細菌、真菌、植物）。去污劑和離液鹽用于裂解細胞和滅活 RNase。當污染物通過時，專門的高鹽緩沖系統允許RNA堿基與磁珠或離心柱的玻璃纖維基質結合。雜質被有效地洗掉，純核酸用水性緩沖液洗脫，無需苯酚提取或醇沉。這些試劑盒是下游PCR分析的理想選擇；靶向病毒基因組的引物可與擴增宿主 DNA RNase P 基因的引物結合使用，該基因也與柱/珠結合并用作內部或提取控制。

病毒RNA提取試劑盒

總 RNA 提取試劑盒

P-9107結果：

當然，當上述方法單獨進行不足以充分純化病毒時，方法組合是一個不錯的選擇。專注于病毒表觀基因組的研究需要高純度的輸入材料，不受宿主 DNA、RNA 或蛋白質的表觀遺傳修飾的干擾。上述方法的組合可以提高病毒回收率、產量和質量。舉例來說，可以擴增低滴度 RNA 病毒，然后從接種的細胞培養物的上清液中回收。在核酸酶處理和離心去除宿主污染物之后，可以使用商業分離試劑盒提取病毒基因組，用于下游m6A RNA 甲基化分析。

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