【Cayman專題】THUNDER TR-FRET助力藥物研發

時間分辨熒光共振能量轉移（TR-FRET）是一種基于熒光共振能量轉移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和時間分辨熒光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)的技術，作為一種方便靈活的均相檢測技術，TR-FRET現今已成為生命科學基礎研究和藥物研發中最為常用的檢測方法之一。

THUNDERTM TR-FRET由加拿大Bioauxilium公司研發,THUNDER?產品均提供全面驗證數據。其產品線聚焦于細胞水平的檢測，如細胞信號通路相關的細胞因子，磷酸化蛋白，總蛋白，GPCR相關第二信使cAMP檢測等，也涉及適合方法學開發的工具抗體。
 

THUNDER^? TR-FRET技術原理圖

一、熒光共振能量轉移（FRET）

利用兩種熒光基團能量轉移，分別是能量供體Europium Chelate（Donor）和能量受體Far-red dye（Accpeptor）。當供體和受體相互靠近（1-10nm），320/340nm光激發Europium，光子能從供體轉移到受體上（615nm），受體發出熒光（665nm）。

FRET技術原理圖

二、時間分辨熒光（TRF）

利用鑭系元素（Eu）的獨特性質，其熒光半衰期長達ms級別。延遲50~100μs開始讀值后，未結合的受體熒光和背景熒光均已淬滅，即反映樣本真實情況。
 

TRF技術原理圖

三、THUNDERTM TR-FRET技術優勢

①操作簡單、快速: 

均相檢測技術：無需洗板和包被，只需兩步加樣→檢測，1-2h快速檢測。

②反復讀板，信號穩定:

實驗體系可支持反復讀值，過夜、48h后讀值亦可，如：1h，2h，4h，18h...適合預實驗摸索實驗條件。

③節省樣本：

實驗體系為20μl，樣本僅需15μl。

④高通量，兼容性強：

耗材：兼容94孔，384孔和1536孔微孔板，推薦使用潛孔板以獲得最佳窗口；

儀器：現售酶標儀，安裝有TR-FRET技術模塊均可檢測。

⑤嚴格驗證和篩選：

最優的抗體對組合：全部抗體均從5~20對配對抗體中進行篩選后，進行專業嚴格驗證，以確定最終的抗體對。 

最大窗口：優化供體、受體濃度得到最佳信噪比（S/B）。 

提供最適配的緩沖液和裂解液。

四、THUNDERTM TR-FRET細胞因子檢測試劑盒

THUNDER檢測細胞因子采用經典雙抗夾心模型，抗體結合抗原后，用320/340nm光激發供體Eu，產生熒光共振能量轉移（FRET）后，進而激發受體產生665nm信號。信號強度與細胞因子濃度成正比。
 

THUNDER細胞因子檢測原理圖

取15μl樣本或標準品，加入空的微孔板中，再加入5μl的抗體Mix（供體抗體，受體抗體各2.5μl），孵育2h，酶標儀讀值。

THUNDER細胞因子檢測流程

THUNDER Human IFNγ 細胞因子檢測數據展示

熱門細胞因子/生物標志物檢測試劑盒：

五、THUNDERTM TR-FRET磷酸化/總蛋白檢測試劑盒

THUNDER檢測胞內磷酸化蛋白采用經典雙抗夾心模型，抗體結合抗原后，用320/340nm光激發供體Eu，產生熒光共振能量轉移（FRET）后，進而激發受體產生665nm信號。信號強度與胞內蛋白磷酸化水平成正比。

THUNDER磷酸化蛋白檢測原理圖

第一步：細胞處理，需5分鐘或過夜，激動劑/抑制劑處理細胞；第二步：細胞裂解，15~60分鐘；第三步：檢測，加檢測抗體對，孵育1小時或過夜，酶標儀檢測。

THUNDER磷酸化/總蛋白檢測原理圖

THUNDER磷酸化ERK部分檢測數據展示

六、THUNDERTM TR-FRET cAMP檢測試劑盒

THUNDER cAMP試劑盒采用競爭法檢測，Eu通過鏈霉親和素和生物素結合cAMP，受體FR-anti-cAMP特異性識別cAMP，當藥物作用于GPCR膜蛋白后，胞內產生cAMP會與FR-anti-cAMP抗體結合，競爭原有的信號，信號呈現倒S曲線，與cAMP濃度成反比。

THUNDER cAMP檢測原理圖

首先進行細胞培養處理（給藥處理），細胞裂解后依次加入cAMP和檢測抗體對，孵育1小時，使用酶標儀進行檢測。
 

THUNDER cAMP驗證數據展示

THUNDER cAMP檢測試劑盒：