Synaptic Systems：WB堿性磷酸酶檢測方案

在標準的西方印跡（WB）方法中，蛋白質樣品通過變性SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）根據它們的分子量進行分離，轉移到膜上，并通過抗體的免疫檢測進行分析。

堿性磷酸酶（AP）染色是一種累積檢測系統。在顯影過程中可以輕松觀察到顏色沉淀，并且當達到所需的信號強度時可以停止染色反應。與增強化學發光（ECL）檢測相比，AP染色的靈敏度較低，但不需要特殊的成像設備來觀察檢測結果。

重要提示：一些蛋白質需要特殊的要求才能良好分離（例如未煮沸的樣品或特殊的凝膠系統）。請參閱各自數據表中關于西方印跡的備注部分。

艾美捷Synaptic Systems--WB--堿性磷酸酶檢測材料和試劑：

1、Ponceau S染色溶液：5%乙酸，0.1% Ponceau S

2、5%脫脂牛奶在含有Tween 20的Tris緩沖鹽水中（5%脫脂牛奶-TBST）：20 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，5%（w/v）脫脂奶粉，0.02%疊氮化鈉，0.1% Tween 20

3、堿性磷酸酶的底物緩沖液：100 mM Tris-HCl，pH 9.5，100 mM NaCl，5 mM MgCl2

4、BCIP染色溶液：20 mg/ml在100%二甲基甲酰胺中

5、NBT染色溶液：50 mg/ml在70%二甲基甲酰胺中

6、完整的染色溶液：每10 ml底物緩沖液中含有80 ?l BCIP溶液和60 ?l NBT溶液。使用前短時間準備此溶液。

7、一抗

8、堿性磷酸酶（AP）偶聯的二抗檢測試劑

程序：

使用SDS-PAGE分離待檢測的蛋白質樣品和分子量標準，并通過電泳轉印到硝酸纖維素膜上。按照您的SDS-PAGE和轉印設備的制造商說明操作。

1、使用Ponceau S染色溶液在室溫下染色數分鐘，以檢查轉移效率。

2、用水沖洗膜以去除Ponceau S染色溶液，并在室溫下在實驗室搖床中用5%脫脂牛奶-TBST孵育30分鐘。

3、在室溫下在實驗室搖床中用新鮮的5%脫脂牛奶-TBST含有適當稀釋的一抗孵育至少2小時，或在4°C下過夜。

4、用5%脫脂牛奶-TBST沖洗3-4次，每次10分鐘。

5、用新鮮的5%脫脂牛奶-TBST含有推薦的AP偶聯二抗（例如抗小鼠IgG，抗兔IgG）在適當的稀釋下至少孵育1小時。

6、用5%脫脂牛奶-TBST沖洗3次，每次10分鐘。

7、用底物緩沖液沖洗并平衡5分鐘。

8、更換新鮮的完整的染色溶液并顯影15-30分鐘。如果信號非常強或弱，可以適當縮短或延長時間。

9、用H2O沖洗3次以停止染色反應。

注：Synaptic Systems標準協議在SYSY實驗室中產生了良好的結果，并且可以用作參考。然而，為了獲得高的特異性信號和低的非特異性背景信號，必須單獨確定合適的抗體濃度、孵育溫度和孵育時間。

艾美捷科技是Synaptic Systems的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。