Synaptic Systems：ICC染色-甲醛固定方案

這個協議適用于甲醛（FA）固定的細胞的免疫細胞化學分析。科學家們使用自制的FA固定液，通過在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中溶解對甲醛（PFA），或者他們使用含有不同量的甲醇以穩定化的現成FA固定液。在我們的標準ICC協議中，我們使用含有少量甲醇的現成FA溶液。最佳的固定時間可能因細胞類型、細胞室或抗體而異。過短或過長的固定時間可能導致細胞結構完整性差或抗原掩蔽。在我們的標準協議中，我們采用15分鐘4% FA固定以獲得良好的結果。然而，有些抗體需要更短/更溫和的FA固定，甚至需要甲醇或丙酮固定，因為表位容易被FA交聯掩蔽（請參閱備注部分以獲取不同的固定協議）。

重要提示：一些蛋白質需要特殊的要求才能良好檢測。請參閱各自數據表中關于ICC的備注部分。

艾美捷Synaptic Systems--ICC染色-甲醛固定的材料和試劑：

1、PBS：磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4

2、固定緩沖液：4% FA（或4% PFA）在PBS中，pH 7.4，4%蔗糖

3、封閉緩沖液：10%正常血清，0.1% Triton X-100在PBS中（建議使用二抗宿主物種的正常血清進行封閉）

4、孵育緩沖液：5%正常血清，0.1% Triton X-100在PBS中（可以省略Triton；建議使用二抗宿主物種的正常血清進行封閉）

5、封片介質

6、可選：DAPI核染色

程序：

1、用PBS簡要沖洗細胞。

2、用固定緩沖液固定細胞15-20分鐘。

3、用PBS沖洗三次，每次10分鐘。

4、用封閉緩沖液孵育30分鐘。

5、在孵育緩沖液中含有一抗（適當稀釋，請參閱數據表）孵育2小時。

6、用PBS沖洗三次，每次10分鐘。

7、在孵育緩沖液中含有二抗孵育1小時（最佳稀釋必須通過實驗確定）?？蛇x：在二抗溶液中加入DAPI。使用二抗時避免強光以最小化熒光染料的光漂白。重要提示：當使用熒光素偶聯的一抗時，可以省略這一步。在多重染色中，確保使用對您實驗中使用的其他一抗宿主物種進行過交叉吸附的二抗。理想情況下，所有二抗應來自同一宿主物種。如果不是，請確保它們也已經對其他二抗的宿主物種的IgG進行了交叉吸附。這避免了二抗之間的交叉反應。

8、用PBS沖洗三次，每次10分鐘。

9、封片并用顯微鏡觀察。

注：Synaptic Systems標準協議在SYSY實驗室中產生了良好的結果，并且可以用作參考。然而，為了獲得高的特異性信號和低的非特異性背景信號，必須單獨確定合適的抗體濃度、孵育溫度和孵育時間。

艾美捷科技是Synaptic Systems的中國代理商，為科研工作者提供優質的產品與服務。