OxiSelect 48孔彗星檢測試劑盒：操作流程與數據分析指南

一、研究背景

DNA損傷是細胞在環境因素（如紫外線、化學誘變劑）及自身代謝過程（如氧化磷酸化產生的活性氧）雙重作用下持續發生的分子事件。據統計，每個哺乳動物細胞每天約發生1000至100萬次DNA損傷事件。盡管這一數字相對于人類基因組約60億個堿基的總量而言比例甚低，但若關鍵基因（如抑癌基因、DNA修復基因）上的損傷未能被及時正確修復，將導致細胞功能紊亂，顯著增加腫瘤發生的風險。

彗星檢測，亦稱單細胞凝膠電泳，是目前評估單個細胞DNA損傷程度最常用的技術之一。其原理是：在電場作用下，含有鏈斷裂或堿基損傷的DNA片段因分子量較小、負電荷較多，會從細胞核中遷移出來，與完整DNA分離，經DNA熒光染料染色后，在顯微鏡下呈現形似“彗星”的拖尾圖像。研究人員通常通過測量彗尾長度、尾部DNA百分比及尾矩等參數對DNA損傷進行定量分析。

二、產品概述與檢測原理

由艾美捷代理Cell Biolabs公司推出的OxiSelect 48孔彗星檢測試劑盒（貨號：STA-845），是一種快速、靈敏的細胞DNA損傷檢測方案。每套試劑盒可完成48次檢測（48孔專用玻片一塊），適用于藥物篩選、環境毒理學評價及DNA修復機制研究。

檢測原理（堿性彗星檢測流程）：

1. 細胞包埋：將待測單細胞懸液與熔融的低熔點瓊脂糖按比例混合，迅速加樣至48孔彗星檢測專用玻片的各孔中，4℃凝固，使細胞固定于瓊脂糖凝膠微環境內。

2. 裂解與解旋：加入裂解緩沖液（含高濃度鹽和去垢劑）去除細胞膜、胞漿蛋白及核膜，暴露核DNA；隨后用堿性溶液處理，使DNA雙鏈解旋變性，并將DNA單鏈斷裂和雙鏈斷裂轉化為可遷移的單鏈缺口。

3. 電泳：在水平電泳槽中進行堿性電泳（推薦條件：33 V，300 mA，15分鐘）。受損DNA片段因其分子量小、帶負電荷，在電場中遷移距離長；完整DNA因分子量大、超螺旋結構復雜，遷移距離短。

4. 染色與觀察：電泳結束后，干燥玻片，用DNA染料（如Vista Green）染色，通過熒光顯微鏡（激發波長約490 nm，發射波長約520 nm）觀察并采集圖像。受損細胞呈現典型的“彗星”形態，拖尾長度和尾部熒光強度與DNA損傷程度正相關。

三、試劑盒組分與儲存

試劑盒在室溫下運輸，各組分及儲存要求如下：

組分名稱 | 貨號 | 規格 | 儲存條件

48孔彗星檢測專用玻片 | STA-846 | 1塊（48孔） | 室溫

彗星瓊脂糖（無菌） | 235002 | 15 mL瓶 | 室溫

Vista Green DNA染料（10000×） | 235003 | 5 ?L管 | -20℃

EDTA溶液（500 mM） | 235004 | 50 mL瓶 | 室溫

10×裂解液 | 235005 | 20 mL瓶 | 室溫

用戶自備材料：

NaCl粉末、NaOH顆粒、10 N NaOH（用于pH調節）

DMSO（可選）、70%乙醇

TE緩沖液（10 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA）

PBS（不含Mg??和Ca??）、去離子水

EDTA（二鈉鹽）

四、試劑配制方法

1. 彗星瓊脂糖的液化

將瓊脂糖瓶置于90-95℃水浴中加熱20分鐘，直至瓊脂糖完全熔融。隨后轉移至37℃水浴中平衡20分鐘，并保持于37℃待用（避免提前凝固）。注意：加熱時瓶蓋應略微旋松以防爆裂，液化后不可重新加熱。

2. Vista Green DNA染液（1×）

將10000×濃縮染料用TE緩沖液按1:10000比例稀釋（例如：5 ?L染料 + 50 mL TE緩沖液）。染液可在4℃避光保存3周。該染料靈敏度高，使用前應充分混勻，避免反復凍融。

3. 1×裂解液（以配制100 mL為例）

組分 | 終濃度 | 加入量

10×裂解液 | 1× | 10 mL

NaCl | 2.5 M | 14.6 g

EDTA（自備） | 100 mM | 3.72 g

去離子水 | — | 補至100 mL

配制步驟：稱取NaCl和EDTA，加入約80 mL去離子水溶解；再加入10 mL 10×裂解液，攪拌至完全溶解；用去離子水定容至100 mL。調節pH至10.0（使用10 N NaOH）。若實驗需要抑制核酸酶活性，可臨用前加入DMSO至終濃度10%。

五、結果計算與分析

DNA損傷通過測量細胞核遺傳物質（彗頭）與遷移產物（彗尾）之間的位移進行定量。最常用的兩個參數為尾部DNA百分比和尾矩。建議每個樣本至少分析50-100個細胞，以獲得統計學意義。

圖3：彗星實驗中的典型受損DNA。

Tail DNA% = 100 x Tail DNA Intensity/CellDNA IntensityTail Moment can be measured using one of thefollowing methods:

(a) Olive Tail Moment = Tail DNA% x TailMoment Length*

(b) Extent Tail Moment = Tail DNA% x Length ofTail (見上圖)

A number of Comet Assay analysis softwareprograms are commercially available, such as andComet Assay IV (Perceptive Instruments) andCASPlab.

*Tail Moment Length is measured from the centerof the head to the center of the tail (see Figure 3)

六、相關產品信息

如需更高或更低通量，可選用以下同系列產品：

DNA雙鏈斷裂染色試劑盒 | STA-321

氧化性DNA損傷定量試劑盒（AP位點） | STA-324

3孔彗星檢測試劑盒 | STA-350 | 15次檢測

24孔彗星檢測試劑盒 | STA-835 | 24次檢測

96孔彗星檢測試劑盒 | STA-855 | 96次檢測

七、注意事項

1. Vista Green DNA染料需嚴格儲存于-20℃，其他組分室溫保存即可。染色液配制后應在3周內使用。

2. 低熔點瓊脂糖與細胞混合前需冷卻至37℃左右，以免熱損傷細胞。

3. 電泳條件（電壓、電流、時間）應根據細胞類型和預期損傷程度進行預實驗優化。圖示結果（依托泊苷處理Jurkat細胞）僅供參考。

4. 實驗全程應避光操作（特別是染色后），防止熒光淬滅。

5. PBS必須不含Mg??和Ca??，否則可能影響瓊脂糖凝固及細胞包埋效果。

文獻參考：

1. Ostling, O., and Johanson, K. J. (1984). Micro gel electrophoretic study of radiation induced DNAdamages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 291–298.

2. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., and Schneider, E. L. (1988). A simple technique forquantification of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell. Res. 175, 184–191.

3. Olive, P. L., Banath, J. P., and Durand, R. E. (1990a). Heterogeneity in radiation induced DNAdamage and repair in tumor and normal cells using the "Comet" assay. Radiat. Res. 122, 86–94.4. De Boeck, M., Touil, N., De Visscher, G., Vande, P. A., and Kirsch-Volders, M. (2000). Validationand implementation of an internal standard in Comet assay. Mutat. Res. 469, 181–197.