RPE-Cy7串聯染料丨抗體修飾、PE串聯激活方法

PE-Cy5是屬于藻膽蛋白綴合物家族的串聯染料。在這種類型的串聯染料中，激發能可以從PE轉移到Cy5，zui大發射波長為Cy5。PE-Cy5與FITC和PE具有zui小的光譜重疊，導致低熒光干擾。因此，它在實驗中與FITC和PE聯合使用。需要注意的是，PE-Cy5不適合與APC配對，因為它們具有顯著的光譜重疊。與PE-Cy5相比，PE-Cy5.5對FITC、PE和APC的熒光干擾最小，使其與這些染料的組合相容。此外，與PE-Cy5相比，PE-Cy5.5表現出更高的熒光強度。PE-Cy7與FITC沒有光譜重疊，與APC的重疊zui小，使其能夠與FITC、PE和APC結合使用。然而，需要注意的是，PE-Cy7對光漂白高度敏感，并且在實驗期間需要嚴格的光保護環境。

艾美捷RPE-Cy7串聯染料：

Cat #：B-CHM311/B-CHM312/B-CHM314/B-CHM315

規格：1 mg/10 mg

儲存：儲存溫度為4°C，避光。

形式：固體

純度：Amax/A280>5.0

儲存條件：儲存溫度為4°C，避光，不結冰。

穩定性：在適當的儲存條件下穩定至少6個月

RPE-Cy7串聯染料使用說明：

1.抗體修飾

1） 將抗體修飾試劑（DTT/TCEP）溶于ddH2O中，制備2 mg/ml抗體修飾緩沖液。

2） 使用PBS緩沖液將待標記抗體的濃度（純度>90%）調節至約5-10 mg/ml。向每毫克抗體中加入10μl抗體修飾緩沖液，輕輕混合。在室溫下攪拌混合物60-90分鐘。

3） 反應完成后，將混合物轉移到離心過濾管中，并加入MES緩沖液。離心過濾器多次以除去過量的抗體修飾緩沖液。過濾器中收集的溶液是經修飾的抗體，應將其調節至1-5mg/ml的濃度。

2.PE串聯激活

1） 將PE串聯溶于濃度為5-10mg/ml的0.1M PBS（pH 7.4，5mM EDTA）中。

2） 將SMCC溶解在無水二甲基亞砜中，制備10mg/ml的儲備溶液。

3） 每mg PE串聯染料添加Sul的SMCC（n（PE串聯）：n（SMCC）=1:80）。用鋁箔密封反應混合物，并在室溫下旋轉1小時，使PE串聯上的氨基與琥珀酰亞胺酯反應，形成衍生的PE串聯。

4） 反應完成后，將反應混合物轉移到超濾離心管中，并在4°C、12000g下離心5分鐘以除去濾液。加入500μul MES緩沖液，混合并離心。重復此步驟5次。

5） 收集活化的PE串聯溶液。

3.活化的PE串聯與抗體的結合

1） 使用MES緩沖液將活化PE串聯的濃度調節至5 mg/ml。為了獲得活性PE串聯的準確重量，我們建議使用活性PE串聯形式測量的消光系數（[PE串聯]=0.1245×A565，其中[PE串聯]是以mg/ml為單位的濃度，A565是565nm處的吸光度，優選在0.3-0.8的范圍內）。

2） 將修飾的抗體與活化的PE串聯以1:3的質量比混合（3mg修飾的抗體的活化的PE串列排列）。在室溫下避光反應2小時。

3） 將NEM溶解在無水二甲基亞砜（DMSO）中，制備12.5 mg/ml溶液（0.1 M）。在步驟2）的反應混合物中，每毫克抗體加入5μl-NEM溶液，以阻斷任何剩余的活性基團。

4） 將步驟3）中的溶液轉移到離心過濾管中，并通過重復離心去除阻塞緩沖液。

5） 將標記的抗體分成等分，添加適當的防腐劑，并在-20°C下儲存以備將來使用。

注意事項：

1.活性PE串列應在黑暗中冷藏。在貼標簽的過程中，應盡可能避免光線照射。

2.封閉試劑和修飾試劑應新鮮配制，并立即使用。它們不應該存放很長時間。

3.標記的抗體應具有高特異性和不低于90%的純度。單克隆抗體是首選，溶液中不應含有游離胺。最好使用PBS。在標記之前，抗體應該耗盡NaN3和BSA。透析、濃縮和濃度測量等操作可能會導致抗體損失。因此，應根據具體情況確定用于標記的抗體的適當量。

4.由于修飾抗體中引入的基團對再氧化的敏感性，修飾后的抗體應盡快與活化的PE串聯偶聯。

PE-Cy7:

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