預活化，APC-AF750：更高的FRET效率和信號

異藻藍蛋白（APC）是從螺旋藻中分離得到的一種藻膽蛋白。與其他藻膽蛋白一樣，APC表現出熒光，并具有高消光系數和量子產率。它可以使用傳統的蛋白質交聯技術與抗體和其他蛋白質偶聯，而不會改變其光譜特性。其在633nm和647nm處的強吸收使其及其串聯物成為流式細胞術應用中與紅色激光結合使用的首選熒光染料之一。APC-AF700和APC Alexa Fluor 700串聯染料具有相同的結構。它們的主要吸收峰在651nm處，發射峰在710nm附近。APC-AF750串聯是APC-Cy7的一個極好的替代品，提供更高的FRET效率和信號。它的主要吸收峰在651nm，發射峰在780nm附近

艾美捷預活化，APC-AF750：

Cat #: 目錄號：B-CHM310/B-CHM316/B-CHM317

規格：1 mg

儲存：儲存溫度為4°C，避光。

形式：解決方案激光：Laser633

儲存條件：儲存溫度為4°C，避光保存，不得冷凍。

穩定性：在適當的儲存條件下穩定至少6個月。

預活化，APC-AF750使用說明：

1.抗體修飾

1） 將抗體修飾試劑（DTT/TCEP）溶于ddH20中，制備2mg/ml抗體修飾緩沖液。

2） 使用PBS緩沖液將待標記抗體的濃度（純度>90%）調節至約5-10 mg/ml。向每毫克抗體中加入10μl抗體修飾緩沖液，輕輕混合。在室溫下攪拌混合物60-90分鐘。

3） 反應完成后，將混合物轉移到離心過濾管中，并加入MES緩沖液。離心過濾器多次以除去過量的抗體修飾緩沖液。過濾器中收集的溶液是經修飾的抗體，應將其調節至1-5mg/ml的濃度。

2.APC串聯激活

1） 將APC串聯溶于濃度為5-10mg/ml的0.1M PBS（pH 7.4，5mM EDTA）中。

2） 將SMCC溶解在無水二甲基亞砜中，制備10mg/ml的儲備溶液。

3） 每mg APC串聯染料添加5ul的SMCC（n（APC串聯）：n（SMCC）=1:80）。用鋁箔密封反應混合物，并在室溫下旋轉1小時，以使APC串聯上的氨基與琥珀酰亞胺酯反應，形成衍生的APC串聯。

4） 反應完成后，將反應混合物轉移到超濾離心管中，并在4℃、12000g下離心5分鐘以除去濾液。加入500μl MES緩沖液，混合并離心。重復此步驟5次。

5） 收集活化的APC串聯溶液。

3.活化的APC串聯與抗體的結合

1） 使用MES緩沖液將活化APC串聯的濃度調節至5 mg/ml。為了獲得活化APC串聯的準確重量，我們建議使用活化APC串聯形式測量的消光系數（[APC串聯]=0.14999×A651，其中[APC串聯]是以mg/ml為單位的濃度，A651是651nm處的吸光度，優選在0.3-0.8的范圍內）。

2） 將修飾的抗體與活化的APC串聯以1:1.3的質量比混合（每mg修飾的抗體1.3 mg活化的APC串列）。在室溫下進行反應，避光2小時。

3） 將NEM溶解在無水二甲基亞砜（DMSO）中，制備12.5 mg/ml溶液（0.1 M）。每毫克抗體向步驟2）的反應混合物中加入5μl的-NEM溶液，以阻斷任何剩余的活性基團。

4） 將步驟3）中的溶液轉移到離心過濾管中，并通過重復離心去除阻塞緩沖液。

5） 將標記的抗體分成等分，添加適當的防腐劑，并在-20°C下儲存以備將來使用。

注意事項：

1.激活的APC串聯應在黑暗中冷藏。在貼標簽的過程中，應盡可能避免光線照射。

2.封閉試劑和修飾試劑應新鮮配制，并立即使用。它們不應該存放很長時間。

3.標記的抗體應具有高特異性和不低于90%的純度。單克隆抗體是首選，溶液中不應含有游離胺。最好使用PBS。在標記之前，抗體應該耗盡NaN3和BSA。透析、濃縮和濃度測量等操作可能會導致抗體損失。因此，應根據具體情況確定用于標記的抗體的適當量。

4.由于修飾抗體中引入的基團對再氧化的易感性，修飾后的抗體應盡快與活化的APC串聯偶聯。

APC-AF750:

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