LifeSensors丨艾美捷MG780：分子膠體外泛素化實驗試劑盒的原理與應用

背景知識

泛素及其連接機制

泛素是一種小分子多肽，能夠通過其C末端與目標蛋白上的賴氨酸殘基的氨基發生共價結合，這一過程被稱為單泛素化。此外，還可以通過泛素分子上存在的七個賴氨酸殘基中的任何一個，將更多的泛素分子連接到初始泛素上，形成泛素鏈，這一過程被稱為多泛素化。其中，通過泛素分子上第48位賴氨酸（K48）形成的泛素鏈是最為人們所熟知的。單泛素化已被證明可以改變目標蛋白的定位、活性和/或功能。而多泛素化最常見的結果是通過蛋白酶體介導的目標蛋白降解。

泛素與目標蛋白的結合需要三種不同酶的協同作用，即E1（泛素激活酶）、E2（泛素結合酶）和E3（泛素連接酶），最終在泛素的C末端與目標蛋白上的賴氨酸殘基的ε-氨基之間形成異肽鍵。泛素E3連接酶作為支架蛋白，為泛素結合酶（E2）和目標底物提供結合位點。通常情況下，E3連接酶介導泛素從E2硫酯中間體轉移到目標蛋白的酰胺鍵上。除了對底物進行泛素化外，E3連接酶還可以自身泛素化。艾美捷作為LifeSensors的獨家代理商，將詳細介紹：

分子膠（Molecular Glue）

分子膠（蛋白質降解靶向嵌合分子）通過人為地劫持泛素蛋白酶體系統（UPS）的組分來降解目標蛋白。分子膠藥物是單價小分子，能夠與E3連接酶結合，使其能夠泛素化一個新的底物或目標蛋白。理論上，將這兩個實體拉近會導致目標蛋白的多泛素化和蛋白酶體降解。然而，鑒于這種情況的復雜性，并不總是如預期那樣發生，分子膠的發現策略面臨著許多挑戰和陷阱。目前的實驗方法解決了許多這些挑戰，并作為一種工具，通過監測分子膠介導的泛素化來有效報告真正的分子膠效率。

適用范圍

體外泛素化試劑盒旨在建立一種高通量方法，通過監測目標蛋白的內在泛素化能力，準確預測分子膠的效率。我們提供針對三種E3泛素連接酶（Cereblon、VHL和HDM2）的試劑盒，用于監測分子膠介導的泛素化，以選擇目標蛋白。

實驗原理

使用預先涂有專有TUBE試劑的微量滴定板條（實驗板）來捕獲分子膠依賴反應中形成的多泛素鏈。在實驗中，分子膠與E3連接酶和目標蛋白（未包含）一起孵育，以促進三元復合物的形成。接下來，加入含有泛素和ATP的E1-E2酶混合物以啟動分子膠介導的泛素化。由E1-E2-E3-分子膠-目標蛋白機制產生的多泛素鏈被捕獲在孔中，經過洗滌后，使用針對目標蛋白（未包含）的抗體和與HRP（包含）結合的二抗通過化學發光進行檢測。因此，這種類似“三明治”ELISA的實驗中產生的信號是分子膠活性的定量測量。

LifeSensors 分子膠體外泛素化實驗試劑盒優勢：

1. 在高通量篩選（HTS）格式下，通過監測泛素化來監測分子膠活性，選擇您感興趣的目標蛋白。

2. 同時篩選多種分子膠變體。

3. 準確建立排序效力，指導藥物化學家進行可靠的結構活性關系（SAR）研究。

4. 通過合理設計依賴于功能性實驗的分子膠，這些實驗報告蛋白質的“泛素化潛力”，加速分子膠藥物的發現和臨床開發。

5. 該檢測策略不需要對泛素進行非天然標記或標記，這可能導致實驗偽影。

建議用途

1. 測試和比較多種分子膠的活性，并建立與DC50的相關性。

2. 比較分子膠與CRBN或其他E3連接酶的活性。

3. 測試分子膠目標蛋白的特異性和亞型選擇性。

試劑盒組成

1. 體外泛素化實驗板

- 注意：不要將實驗板快速解凍至室溫。建議將實驗板在4°C下放置30分鐘，然后再轉移到室溫。

2. 實驗緩沖液（10倍）–1 x 1.2 mL

- 重要提示：在1倍實驗緩沖液中加入β-巰基乙醇，使其最終濃度達到1 mM。

3. E3混合液（20倍）–1 x 250 uL

4. E1-E2-泛素混合液（20倍）–1 x 250 uL

5. 二抗（抗小鼠或抗兔HRP結合物，100倍）–1 x 60uL

6. 檢測試劑DR1和DR2（2倍）–1 x 1 mL過氧化氫和1 x 1 mL魯米諾

7. 封閉濃縮液（5倍）–1 x 5 mL

8. 陽性對照試劑：

- 生物素-多泛素鏈（20倍）：1 x 25 uL

- 鏈霉親和素HRP（100倍）：1 x 10 uL

儲存和穩定性

將所有材料儲存于-80?C。避免多次凍融循環。如果在適當的溫度下儲存，所有組分至少穩定6個月。

更多分子膠體外泛素化實驗試劑盒信息，詳詢LifeSensors獨家代理商艾美捷科技。