Bioauxilium THUNDER 磷酸-4EBP1（T37/T46）+總4EBP1 TR-FRET細胞信號檢測試劑盒驗證數據說明

磷酸化 4EBP1（T37/T46）+ 總 4EBP1 檢測試劑盒是一種均相時間分辨熒光共振能量轉移（TR-FRET）夾心免疫檢測法（圖 1）。THUNDER? 細胞信號檢測試驗流程包括 3 個步驟（圖 2）。細胞經過處理后，首先使用試劑盒提供的專用裂解緩沖液將細胞裂解。然后在不同的孔中，分別使用兩對熒光標記的抗體以簡單的“添加 - 孵育 - 測量”格式（單步試劑添加；無需洗滌步驟）檢測細胞裂解液中的磷酸化 4EBP1（T37/T46）和總 4EBP1。對于磷酸化蛋白的檢測，一個抗體標記有供體熒光團（Europium 配合物；Eu-Ab1），另一個標記有遠紅光受體熒光團（FR-Ab2）。檢測總蛋白的第二對抗體對（Eu-Ab3 和 FR-Ab4）也采用相同的方法。兩種匹配的標記抗體結合到目標蛋白（磷酸化 4EBP1 或總 4EBP1）的不同表位上，使兩種染料靠近。用閃光燈（320 或 340 nm）或激光（337 nm）激發供體 Europium 配合物分子，會觸發從供體到受體分子的 FRET，受體分子隨后在 665 nm 處發射 TR-FRET 信號。Eu 配合物的剩余能量在 615 nm 處產生光。665 nm 處的信號與細胞裂解液中磷酸化 4EBP1（T37/T46）和總 4EBP1 的濃度成正比。數據可以表示為 665 nm 處的信號，或 665 nm/615 nm 的比值。

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THUNDER 磷酸-4EBP1（T37/T46）+總4EBP1 TR-FRET細胞信號檢測試劑盒組分：

銪磷-4EBP1（20uL）

鈣磷-4EBP1（80uL）

銪總量4EBP1（5uL）

Acc總計4EBP1（20uL）

4EBP1對照裂解液（200uL）

5X裂解緩沖液2（5 mL）

10倍TR-FRET檢測緩沖液（250uL）

100X磷酸酶抑制劑雞尾酒（250uL）

驗證數據：

該試劑盒已通過驗證，可用于 A431 和 HEK293 細胞裂解液中磷酸化 4EBP1（T37/T46）和總 4EBP1 的相對定量檢測，采用雙板檢測協議。

貼壁細胞在 96 孔細胞培養板中培養過夜（HEK293 使用 EMEM + 10% 胎牛血清；A431 使用 DMEM + 10% 胎牛血清）。用于 HEK293 的培養板預先涂覆了聚-L-賴氨酸。

細胞經過處理后，移除培養基，然后用添加了磷酸酶抑制劑（1 mM 氟化鈉和 2 mM 偏釩酸鈉）的 1X 裂解緩沖液 2（50 uL）將細胞裂解。

在室溫下于振蕩器（400 rpm）孵育 30 分鐘后，將裂解液（15 uL）轉移到 384 孔檢測板中，然后分別加入用于檢測磷酸化 4EBP1（T37/T46）的標記抗體 Eu-Ab1 和 FR-Ab2（5 uL），或用于檢測總 4EBP1 的 Eu-Ab3 和 FR-Ab4（5 uL）。

在室溫下孵育 4 小時后，記錄 665 nm 和 615 nm 處的 TR-FRET 信號（使用 EnVision，閃光燈激發）。

BioAuxilium成立于2013年，基于其專有的TR-FRET技術，開發出了數百個用于細胞蛋白和生物標志物定量分析的Thunder系列TR-FRET檢測試劑盒。該公司專注于設計、開發和生產高質量、經過充分驗證的TR-FRET檢測試劑盒，簡化實驗室工作流程，加速生物醫學研究。

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