兔抗γ-H2AX免疫組化抗體親和純化，FFPE組織+細胞雙平臺驗證

在DNA損傷應答研究中，組蛋白H2AX的絲氨酸139位點磷酸化（即γ-H2AX）被公認為DNA雙鏈斷裂（DSB）的敏感標志物。磷酸化后的H2AX在損傷位點迅速聚集，形成肉眼可見的核焦點，為DNA損傷程度評估、藥物基因毒性篩選及放射生物學研究提供了關鍵工具。本文所介紹的由艾美捷Bethyl Laboratories推出的抗 gamma-H2AX（磷酸化 S139）兔多克隆抗體（產品編號 IHC-00059）經親和純化，可特異性識別人及小鼠來源的磷酸化組蛋白H2AX，適用于福爾馬林固定石蠟包埋組織及甲醛固定細胞的免疫組化檢測。以下從靶點特性、抗體規格、免疫組化（IHC/ICC）操作要點及性能特征等方面進行技術說明。

一、靶點蛋白與免疫原設計

本抗體靶向的gamma-H2AX（基因符號：H2AFX，UniProt ID：P16104）是組蛋白H2A家族成員之一。H2AX在染色質中與H2A、H2B、H3、H4共同構成核小體核心結構，但在其C末端含有一個獨特的保守基序（SQEY）。當DNA發生雙鏈斷裂時，PIKK家族激酶（如ATM、ATR、DNA-PKcs）磷酸化H2AX的絲氨酸139（對應Swiss-Prot P16104編號），生成γ-H2AX。

免疫原信息：本抗體采用針對人組蛋白H2AX中圍繞磷酸化絲氨酸139的合成肽段作為免疫原。該表位與未磷酸化的H2AX無交叉反應，亦不識別其他H2A家族成員（如H2A.1、H2A.2）。通過抗原親和純化（使用固定在固相載體上的特異性表位肽段），從兔抗血清中純化出高特異性的IgG抗體。最終抗體形態為全分子IgG，未偶聯標記，濃度為100 μg/ml。

種屬反應性：已驗證可識別人（Human）和小鼠（Mouse）來源的γ-H2AX。這得益于磷酸化S139表位在哺乳動物中的高度保守性，因此該抗體也推薦用于大鼠等其他模式生物（需自行驗證）。

二、抗體規格與儲存條件

項目 | 具體參數

抗體名稱 | IHC-00059

靶標 | gamma-H2AX（phospho S139）

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

形式 | 全分子IgG

亞型 | IgG

標記 | 未偶聯（Unconjugated）

純度 | 抗原親和純化

濃度 | 100 μg/ml

緩沖液 | Tris-緩沖鹽水，含0.1% BSA及0.09%疊氮鈉

儲存條件 | 2-8°C

有效期 | 收貨后1年

儲存注意事項：抗體溶液含疊氮鈉作為防腐劑，可2-8°C冷藏，請勿冷凍。反復凍融會導致蛋白聚集和活性下降。如需長期保存，建議分裝成單次使用量并置于-80°C（但原廠有效期1年是在2-8°C條件下驗證，冷凍可能改變抗體濃度分布，推薦按說明冷藏）。疊氮鈉會抑制過氧化物酶活性，如果后續計劃與HRP標記二抗聯用，需在染色前充分洗脫（不影響常規IHC二抗體系）。

三、應用方法與實驗條件推薦

本抗體專用于免疫組織化學及免疫細胞化學，已驗證的推薦稀釋度和前處理要求如下。

1. 福爾馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）

稀釋范圍：1:100 – 1:500（建議起始稀釋1:200）

抗原修復：強烈推薦使用檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0） 進行熱誘導表位修復（HIER）。可采用微波爐（高火10分鐘）、高壓鍋（2-3分鐘）或水浴鍋（95°C，20分鐘）方式。修復后自然冷卻至室溫再進行封閉。

染色流程：常規脫蠟水化后，3% H?O?阻斷內源性過氧化物酶（10分鐘）；5%正常山羊血清封閉；一抗4°C孵育過夜或室溫2小時；相應HRP標記二抗；DAB顯色；蘇木精復染。

陽性對照：推薦使用經電離輻射（如2-10 Gy X射線）或化療藥物（如依托泊苷、喜樹堿）處理的扁桃體、睪丸或脾臟組織切片。DNA損傷誘導后30分鐘可見明顯核焦點。

2. 甲醛固定細胞（ICC）

稀釋范圍：1:100 – 1:500

固定與通透：4%多聚甲醛固定15分鐘；0.3% Triton X-100通透10分鐘。

抗原修復：雖然細胞爬片通透性較好，但仍推薦進行檸檬酸鹽緩沖液（pH 6.0）熱修復（于微波爐中低火加熱5-10分鐘），以充分暴露磷酸化表位。若不修復，信號可能較弱。

陽性對照：使用經50 μM依托泊苷處理1小時的HeLa細胞或經輻照的NIH/3T3細胞。

3. 未驗證的應用

本抗體尚未驗證用于Western Blot（WB）或流式細胞術（Flow）。如需WB檢測γ-H2AX，建議選擇特異性針對該磷酸化位點的單克隆抗體（如克隆2F3、JBW301）或已驗證WB的多克隆抗體。IHC-00059僅推薦用于IHC和ICC。

四、性能特征與特異性驗證

1. 表位特異性  

經抗原親和純化后，抗體僅識別磷酸化S139的H2AX。與未修飾的H2AX無交叉反應，也不識別其他組蛋白（H2A、H2B、H3、H4）或非磷酸化的H2AX突變體。這通過ELISA和肽段競爭實驗得到驗證：過量磷酸化肽段可完全阻斷染色信號，而非磷酸化肽段無阻斷效果。

2. 靈敏度  

在推薦的稀釋倍數下（1:200），可檢測到低至單個DNA雙鏈斷裂誘導的γ-H2AX焦點。在組織切片中，該抗體呈現清晰的核染色（點狀或彌散狀，取決于損傷程度）。背景控制良好，無非特異性核或胞漿染色。

3. 批次穩定性  

每批次抗體均經過FFPE組織和輻射處理細胞的IHC質控，確保批間一致性?？贵w在2-8°C儲存1年內，染色強度無明顯下降。