BioAssay Systems 半胱天冬酶-3檢測試劑盒檢測步驟&注意事項

半胱天冬酶（Caspases）是天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶家族的成員，在細胞凋亡中發揮核心作用。凋亡參與多種生理和病理事件，從正常的胎兒發育到癌癥、器官衰竭和神經退行性疾病等疾病。半胱天冬酶-3（Caspase-3）是評估凋亡和理解凋亡誘導機制的關鍵生物標志物。

BioAssay Systems的Caspase-3檢測試劑盒為測定生物樣本中的Caspase-3活性提供了一種便捷的方法。在檢測中，特異性底物（N-Ac-DEVD-AFC）被活化的Caspase-3切割，形成一種高熒光產物。熒光強度（激發/發射波長=400/490 nm）與Caspase-3活性成正比。

作為BioAssay Systems在中國的區域總代理，艾美捷科技強烈推薦BioAssay Systems熱銷產品半胱天冬酶-3檢測試劑盒。產品僅用于科研，不可用于臨床診斷。

主要特點  

- 安全。非放射性檢測。  

- 便捷且高通量。均相“混合-孵育-測量”型檢測法?？稍诟咄亢Y選液體處理系統上輕松自動化，每天可處理數千個樣本。

應用  

- 測定細胞和組織裂解液中的Caspase-3活性。  

- 高通量篩選凋亡誘導劑和抑制劑。

試劑盒內容  

- 檢測緩沖液：12 mL  

- 底物：240 ?L  

- DTT溶液：240 ?L  

儲存條件  

本產品在室溫下運輸。收到后，將所有試劑儲存于-20°C。保質期：收貨后12個月。

注意事項  

試劑僅供研究使用。使用試劑時應遵循實驗室試劑的常規安全措施。請參考材料安全數據表以獲取詳細信息。

96孔板檢測步驟  

注意：以下步驟適用于96孔板的標準檢測。如果細胞不是在96孔板中培養的，需要單獨制備細胞裂解液（參見“一般注意事項”）。建議對照組和樣本組均進行重復檢測。

1. 細胞培養：將100 ?L濃度為1,000 - 100,000個細胞的細胞懸液接種到無菌黑色透明底96孔板的孔中（注意：使用的細胞數量取決于細胞系）。在細胞培養箱中于37°C孵育過夜。

2. 細胞處理：加入10 ?L測試化合物（例如凋亡誘導劑或抑制劑），使其達到所需濃度，并加入10 ?L溶劑（溶解測試化合物的培養基）作為對照。  孵育細胞一段時間。

3. Caspase-3檢測：檢測前，將所有試劑平衡至室溫。短時間離心試劑管。為所有檢測孔準備足夠量的工作試劑。對于每個孔，將100 ?L檢測緩沖液、2 ?L底物和2 ?L DTT混合。  

- 去除檢測孔中的培養基。對于貼壁細胞，直接從孔中吸出培養基；對于懸浮細胞，以500 x g離心5分鐘，小心吸出培養基。  

- 立即向每個檢測孔中加入100 ?L工作試劑。通過在微孔板振蕩器上以100 - 200 rpm的轉速振蕩60秒，使試劑完全混合。工作試劑可裂解細胞并支持最佳的Caspase-3活性。  

- 在37°C下避光孵育微孔板60分鐘。

4. 讀取熒光強度：在激發/發射波長=400/490 nm處讀取熒光強度。  

注意：如果Caspase-3活性較低，可以增加孵育時間，或使用更多細胞。

計算  

從對照孔的熒光強度值中減去樣本孔的熒光強度值。ΔF值表示相對的Caspase-3活性。

一般注意事項  

- 對于未在96孔板中培養的細胞，需要單獨制備細胞裂解液，并用于Caspase檢測。  

- 在細胞經過測試化合物處理一段時間后，去除培養基。對于貼壁細胞，直接吸出培養基；對于懸浮細胞，以500 x g離心5分鐘并吸出培養基。  

- 向每10?個細胞加入300 ?L裂解液（50 mM Hepes，pH 7.2；100 mM NaCl；0.5%（體積比）Triton X-100）裂解細胞。  

- 在4°C下振蕩細胞懸浮液30分鐘。  

- 在4°C下以2,500 x g離心細胞懸浮液10分鐘。  

- 將上清液轉移至干凈的試管中。如果當天不進行檢測，裂解液可在-80°C下保存一個月。  

- 檢測時，將50 ?L樣本裂解液加入黑色96孔板的不同孔中。立即向每個檢測孔中加入100 ?L工作試劑。在37°C下避光孵育微孔板60分鐘。在激發/發射波長=400/490 nm處讀取熒光強度。

標準曲線

左圖：在RBL-2H3和PANC-1細胞系中，staurosporine誘導Caspase-3活性的時間過程。  

右圖：在RBL-2H3（EC?? = 14.2 nM）和PANC-1（EC?? = 13.9 nM）細胞系中，staurosporine誘導Caspase-3活性。

文學：

1. Hug H et al (1999). Rhodamine 110-linked amino acids and peptides as substrates to measure caspase activity upon apoptosis induction in intact cells. Biochemistry 38:13906-11.

2. Jones J, et al (2000). Development and application of a GFP-FRET intracellular caspase assay for drug screening. J Biomol Screen. 5:307-18.

3. Wang ZQ, et al (2005). N-DEVD-N'-morpholinecarbonyl-rhodamine 110:novel caspase-3 fluorogenic substrates for cell-based apoptosis assay.Bioorg Med Chem Lett. 15:2335-8.

BioAssay Systems是一家位于美國北加州灣區的高新技術生物技術公司，專注于研發、生產和銷售高品質的生化檢測試劑盒，產品種類齊全，主要用于科學研究和生物醫藥開發，以滿足生命科學行業日益增長的需求。BioAssay Systems在現代藥物發現領域擁有超過50年的豐富經驗，已經開發了超過250種用于藥物發現和生命科學研究的檢測試劑盒。產品主要包括：1.血液尿液化學；2.酶活性測定；3.能量代謝；4.氧化應激；5.高通量HTS試劑；6.陰陽離子檢測。

作為BioAssay Systems在中國區域的代理，艾美捷科技有限公司將為中國客戶提供全面的BioAssay Systems產品。