EdU法細胞增殖成像分析試劑盒化驗程序詳細說明

細胞增殖導致許多重要的變化，包括DNA合成、細胞代謝增加和增殖特異性蛋白表達?；跓晒馊旧夹g，BiogradetechEdU法細胞增殖成像分析試劑盒可以直接從DNA水平準確檢測細胞增殖狀態，同時還可以通過細胞代謝水平高通量檢測細胞增殖狀態。該試劑盒包含一個專利的增殖陰性對照，是一個完美的解決非標準化的增殖試驗結果。目前主要包括EdU和CCK8兩種常用的檢測方法。  

艾美捷 Biogradetech EdU法細胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）：

Cat #: D-AKK2030

Size: 100T

Storage: Stored at -20°C for 12 months, protected from light

EdU法細胞增殖成像分析試劑盒 供應材料和儲存條件：

化驗程序

A.用Edu標記細胞

在本實驗中，以在96孔板中培養的粘附細胞為例。EdU孵育后可以涂抹懸浮細胞（在載玻片中加入適量細胞，用酒精燈烘烤至干燥）。涂抹后，染色程序與粘附細胞相同。

1.在平板中放置合適的蓋玻片，播種適當數量的細胞，并在處理細胞后使其生長到所需的密度。

2.可選步驟：設置陰性對照：在EdU孵育前加入DNA合成抑制劑羥基脲，按1:1000的比例直接加入陰性對照孔中，混合孵育0.5小時。

用10mM的EdU溶液在介質中制備3.2×EdU工作溶液（20μM）。EdU的推薦最終濃度為10μM，用細胞培養基1:500稀釋10mM EdU可獲得2xEdU工作溶液（20μM）。

4.將相同體積的預熱（37°C）的2xEdU溶液加入到含有測試細胞的培養基中，以將96孔板中EdU的最終濃度改變為1x。

注意：建議不要更換所有培養基，因為這會影響細胞增殖的速率；建議EdU的初始濃度為10μ。

5.在最合適的條件下培養細胞2小時（根據細胞擴增的時間，一般腫瘤細胞的培養時間為2小時）。

6.培養后，除去培養基，并向每個孔中加入0.1mL固定溶液（含有3.7%甲醛的PBS）。室溫孵育15min。

7.取出固定劑，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個孔中的細胞5分鐘。重復3次。

8.取出洗滌劑，向每個孔中加入0.1mL滲透劑（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室溫下孵育15分鐘。

9.去除滲透劑，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個孔中的細胞5分鐘。重復2次。

10.轉到步驟C。

B.EdU標記活體動物

本實驗以6周齡小鼠為例，其他動物EdU的標記，請參閱相關文獻。

1.對于小鼠，根據10-200mg/kg的劑量，EdU可以用PBS制備成一定濃度，腹膜內注射，局部注射特定組織或器官，也可以加入飲用水中。具體劑量與所用動物的類型、重量和使用方式有關，我們可以參考相關文獻，因此建議首次使用時探索EdU的濃度，或直接使用50 mg/kg的強的松濃度。如果你以前在實驗中使用過BrdU，你可以將BrdU的最終濃度稱為EdU的最終濃縮。EdU需要單獨購買。

2.可選步驟：陰性對照的設定：在EdU處理過程中加入DNA合成抑制劑羥基脲，用濃度為1000mg/kg的EdU溶液配制。羥基脲需要單獨購買。

3.24小時后或根據具體實驗確定的適當時間后，迅速殺死小鼠，取出必要的組織，并按照常規步驟制作冷凍切片或石蠟切片。EdU標注的時間也可以參考相關文獻進行調整。

4.對于冷凍切片：

（1） 加入適量固定溶液（含3.7%甲醛的PBS），室溫孵育15分鐘。

（2） 取出固定劑，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個孔中的細胞5分鐘。重復3次。

（3） 取出洗滌劑，向每個孔中加入0.1mL滲透劑（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室溫下孵育15分鐘。

（4） 去除滲透劑，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個孔中的細胞5分鐘。重復2次。

（5） 抗原修復（可選）：如果同時需要對靶蛋白進行免疫熒光染色，并且需要抗原修復，可以使用合適的抗原修復液或自制的合適抗原修復液進行抗原修復。

（6） 轉到步驟C。

5.對于石蠟切片：

（1） 脫蠟：在二甲苯中脫蠟5-10分鐘，然后換成新鮮二甲苯，然后脫蠟5-10分鐘。無水乙醇脫蠟5分鐘，無水乙醇脫蠟3分鐘。95%乙醇3分鐘.85%乙醇3分鐘75%乙醇3分鐘.50%乙醇3分鐘PBS 5分鐘。

（2） 抗原修復（可選）：如果同時需要對靶蛋白進行免疫組織化學染色，并且需要抗原修復，可以使用合適的抗原修復液或自制合適的抗原修補液進行抗原修復。

注意：如果使用蛋白酶K或胰蛋白酶進行抗原修復，必須反復清洗，否則殘留的酶會嚴重干擾后續的標記反應。

（3） 轉到步驟C。

C.EdU檢測

Biogradetech全球生命科學和醫藥研發行業關鍵原料與試劑的領先供應商：Biogradetech成立于2015年，總部位于美國加利福尼亞州，早期以產品技術研發服務起家，逐步發展了廣泛的產品線，并將其商業化銷售，包括蛋白質、抗體、酶、培養基、試劑盒和儀器。適用于細胞生物學、蛋白質組學、分子生物學、免疫學、微生物學、診斷學、生物化學、神經科學、血液分析和高通量藥物篩選等領域。