EdU法細胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）程序分析

EdUCellProliferation試劑盒，用于成像（綠色熒光）是BrdU測定的一種新的替代品。EdU（5-乙炔基-2?-脫氧尿苷）是胸苷的核苷類似物，在活性DNA合成過程中被摻入DNA。與BrdU測定相比，EdU點擊分析不是基于抗體的，因此不需要DNA變性（通常使用HCl或加熱或用DNase消化）來檢測結合的核苷。檢測基于點擊反應，這是疊氮化物和萘醌之間銅催化的共價反應，在30分鐘內完成。

艾美捷EdU法細胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）基本參數：

目錄號：D-AKK2030

規格：100T

儲存：在-20°C下儲存12個月，避光

EdU法細胞增殖成像分析試劑盒（綠色熒光）程序分析：

A.細胞使用EdU標記

在這個實驗中，以96孔板中的貼壁細胞為例。懸浮細胞可以在孵育EdU后涂抹（將適量的細胞加到玻片上，用酒精燈烘干）。涂抹后，染色步驟與貼壁細胞相同。

1. 在孔板中放置適當的玻片，在孔中種植適量的細胞，并在處理細胞后使其達到所需的密度。

2. 可選步驟：設置陰性對照。在EdU孵育之前加入DNA合成抑制劑羥基脲，按1:1000的比例直接加入陰性對照孔中，混勻并孵育0.5小時。

3. 使用細胞培養基中的10mM EdU溶液制備2倍濃度的EdU工作溶液（20μM）。推薦的最終EdU濃度為10μM，通過將10mM EdU與細胞培養基按1:500稀釋可以得到2倍濃度的EdU工作溶液（20μM）。

4. 預熱至37°C的2倍濃度的EdU溶液與含有待測細胞的培養基加入相同體積，使96孔板中EdU的最終濃度為1倍。

注意：推薦不要更換所有培養基，因為這會影響細胞增殖速率；推薦初始EdU濃度為10μM。

5. 在最適宜的條件下孵育細胞2小時（根據細胞擴展的時間，一般腫瘤細胞的孵育時間為2小時）。

6. 孵育結束后，移除培養基，向每個孔中加入0.1mL固定液（含有3.7%甲醛的PBS溶液），在室溫下孵育15分鐘。

7. 去除固定液，用0.1mL BSA工作溶液（1倍濃度）洗滌每個孔中的細胞，孵育5分鐘。重復3次。

8. 去除洗滌液，向每個孔中加入0.1mL穿透劑（含有0.5% Triton X-100的PBS溶液），在室溫下孵育15分鐘。

9. 去除穿透劑，用0.1mL BSA工作溶液（1倍濃度）洗滌每個孔中的細胞，孵育5分鐘。重復2次。

10. 進入C步驟。

B.在活體動物中標記EdU

這個實驗以6周齡小鼠為例，其他動物中EdU的標記，請參考相關文獻。

1. 對于小鼠，根據10-200 mg/kg的劑量，將EdU與PBS混合制成一定濃度，可以通過腹腔注射、局部注射到特定組織或器官，或者加入飲用水中。具體劑量與使用的動物的類型、體重和使用方式有關，可以參考相關文獻，因此建議首次使用時探索EdU的濃度，或直接使用50 mg/kg的濃度進行測試。如果之前使用過BrdU進行實驗，可以參考BrdU的最終濃度作為EdU的最終濃度。EdU需要單獨購買。

2. 可選步驟：設置陰性對照。在EdU處理期間加入DNA合成抑制劑羥基脲，與EdU溶液按照1000 mg/kg的濃度配制。羥基脲需要單獨購買。

3. 經過24小時或根據具體實驗確定的適當時間后，迅速殺死小鼠，取出必要的組織，并根據常規步驟制作冰凍切片或石蠟切片。也可以根據相關文獻調整EdU標記的時間。

4. 對于冰凍切片：

（1）加入適量的固定溶液（含3.7%甲醛的PBS），室溫孵育15分鐘。

（2）取出固定劑，用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個孔中的細胞5分鐘。重復3次。

（3）取出洗滌劑，向每個孔中加入0.1mL滲透劑（含有0.5%Triton X-100的PBS），并在室溫下孵育15分鐘。

（4）去除滲透劑，并用0.1mL BSA工作溶液（1x）洗滌每個孔中的細胞5分鐘。重復2次。

（5）抗原修復（可選）：如果同時需要對靶蛋白進行免疫熒光染色，并且需要抗原修復，可以使用合適的抗原修復液或自制的合適抗原修復液進行抗原修復。

（6）轉到步驟C。

5.對于石蠟切片：

（1）脫蠟：在二甲苯中脫蠟5-10分鐘，然后換成新鮮二甲苯，然后脫蠟5-10分鐘。無水乙醇和無水乙醇分別脫蠟5分鐘和3分鐘。95%乙醇3分鐘。85%乙醇3分鐘.75%乙醇3分鐘50%乙醇3分鐘.PBS 5分鐘。

（2）抗原修復（可選）：如果同時需要對靶蛋白進行免疫組織化學染色，并且需要抗原修復，可以使用合適的抗原修復液或自制合適的抗原修補液進行抗原修復。

注意：如果使用蛋白酶K或胰蛋白酶進行抗原修復，必須反復清洗，否則殘留的酶會嚴重干擾后續的標記反應。

（3）轉到步驟C。

C.EdU檢測

注：在該步驟中，每個孔使用100μL反應混合物。對于其他孔板或片，可以根據實際情況調整反應混合物的體積，但必須按比例添加反應組分。

1.根據下表制備Click-iT反應混合物。

注意：按照表中列出的順序添加配料是很重要的；否則，反應不會順利進行。在制備后15分鐘內使用Click-iT反應混合物。

2.取出溶液，向每個樣品中加入100μL Click-iT反應混合物，并在室溫下孵育細胞30分鐘，避光。

3.取出反應混合物，用0.1mL BSA洗滌溶液（1x）洗滌孔中的細胞5分鐘，然后取出洗滌溶液。

4.可選步驟：核染色（1xHoechst 33342）或抗體標記。

重要提示：孵化過程中應避免光線照射。如果您不需要其他染色，請在孵化后直接進行圖像和分析。

5.用熒光顯微鏡（Ex/Em=501/525nm）分析樣品中標記的DNA，用Ex/Em=360/460nm檢測細胞核。

該試劑僅用于科學研究領域，不適用于臨床診斷或其他用途。

Biogradetech生命科學和醫藥研發行業關鍵原料與試劑的供應商：Biogradetech成立于2015年，總部位于美國加利福尼亞州，早期以產品技術研發服務起家，逐步發展了廣泛的產品線，并將其商業化銷售，包括蛋白質、抗體、酶、培養基、試劑盒和儀器。適用于細胞生物學、蛋白質組學、分子生物學、免疫學、微生物學、診斷學、生物化學、神經科學、血液分析和高通量藥物篩選等領域。