SPY555-肌動蛋白探針，明亮且無毒，適用于活細胞和固定細胞

SPY555-actin 是一種基于我們 SPY? 系列染料的明亮且無毒的 F-肌動蛋白染料，適用于活細胞和固定細胞。其優化的結構能夠快速標記活細胞和固定細胞中的 F-肌動蛋白，具有高特異性和極低背景。SPY555-actin 可以在無需遺傳操作或熒光蛋白過表達的情況下，對活細胞或固定細胞的 F-肌動蛋白進行染色。它的吸收光譜和發射光譜與四甲基羅丹明（TMR）相似。SPY555-actin 可以與 SPY505、SPY595、SPY650、SPY700、SiR 和 GFP 進行多色成像。它可以使用標準的 TMR 或 Cy3 濾光片組進行成像，并可用于活細胞或固定細胞和組織的寬場、共聚焦、SIM 或 STED 成像。包含一瓶 SPY555-actin（凍干品）。

艾美捷SPY555-肌動蛋白探針（#CY-SC202）特性：

吸收峰（λabs）：555 nm  

熒光峰（λfl）：580 nm  

是否適用于固定細胞：是，適用于甲醛固定的細胞  

探針數量：100 次染色

熒光壽命：2.4 ns  

STED 消耗波長：660 nm 或 775 nm  

運輸條件：室溫  

儲存條件：-20°C  

儲存與操作  

收到后請將探針保存在 -20°C 或以下。凍干探針在室溫下可穩定保存超過 1 周，在 -20°C 下可穩定保存超過 12 個月。使用無水 DMSO 復溶 SPY555-actin。我們建議使用新開封的無水 DMSO 來制備 1000×儲備液。DMSO 與空氣和水分接觸會產生降解產物，這會顯著縮短探針在溶液中的保質期，即使在 -20°C 下也是如此。使用后，請將 1000×儲備液保存在 -20°C 或以下。在打開小瓶之前，應讓其恢復至室溫。如果儲存得當，1000×儲備液可穩定保存 3 個月。注意：DMSO 溶液應特別小心處理，因為 DMSO 已知會促進有機分子進入組織。請按照所有相關當地法規處理這些試劑。

圖：用共聚焦顯微鏡與STED顯微鏡成像的SPY標記的HeLa細胞的比較。使用93X物鏡拍攝，由Spirochome提供。

標記協議  

注意：本協議是使用貼附在蓋玻片上的 HeLa 細胞優化的，并已在其他常見細胞系中得到確認。本協議中的建議應作為起點，每種細胞類型的最優標記條件應通過實驗確定。SPY555-actin 基于選擇性 F-肌動蛋白配體雅斯普霉素的衍生物。在高劑量下，它可能會改變活細胞中的肌動蛋白代謝。因此，如果計劃進行長期（>12 小時）成像實驗，建議使用 1000 倍或更高倍數稀釋的 SPY555-actin。對于所有其他用途，建議使用 1000 倍稀釋的 SPY555-actin 進行染色。

1. 配制 1000×儲備液  

向 SPY555-actin 小瓶中加入 50 ?L 無水 DMSO，制備 1000×儲備液。我們建議使用新開封的無水 DMSO 來制備 1000×儲備液。DMSO 與空氣和水分接觸會產生降解產物，這會顯著縮短探針在溶液中的保質期，即使在 -20°C 下也是如此。此時，溶液可能會有顏色，但這不會影響探針的性能。使用后，應將該溶液保存在 -20°C 或以下。不要將 1000×儲備液分裝成小份量，因為它們會更快降解，且該探針不會因多次凍融循環而改變。如果儲存得當，該儲備液可穩定保存 3 個月。

2. 配制染色液  

將 SPY555-actin 稀釋到 1×濃度，加入常用的細胞培養基（例如 DMEM + 10% 胎牛血清）中，并短暫渦旋。如果不能一次完成稀釋，請使用 DMSO 制備中間稀釋液，因為使用水性緩沖液制備中間稀釋液會導致探針聚集?？焖龠M行下一步。由于染色效率可能因細胞系而異，建議首次嘗試時使用 1000 倍稀釋液進行染色，然后在后續實驗中優化 SPY555-actin 的稀釋倍數，直至達到最佳染色效果。僅使用新配制的染色液，不要重復使用。

3. 細胞準備與染色  

按照常規方法在蓋玻片、玻璃底培養皿或玻璃底多孔板上培養細胞。當細胞達到所需密度時，用步驟 2 新鮮配制的染色液替換培養基，確保所有細胞都被溶液覆蓋。將細胞置于 37°C、含 5% CO? 的濕潤環境中孵育，并根據下表確定標記時間與探針濃度的關系。

4. 細胞成像  

SPY555-actin 的成像最好使用標準的 TMR 或 Cy3 設置。標記后，活細胞可以立即成像，無需洗滌步驟?？蛇x地，用不含探針的新鮮培養基替換一次標記液，通常可以提高信噪比。如果進行時間序列成像，建議在整個實驗過程中將探針保留在成像介質中，以獲得穩定的信號。如果在成像前對細胞進行了洗滌，染色效果可維持數小時。   

基于以下條件：每次染色實驗使用 0.5 mL 1×探針濃度的染色液。通過減少體積或探針濃度，可以進一步增加染色實驗的次數。  

標記時間是針對 HeLa 細胞確定的，可能會因使用的細胞系而有所不同。