Rho 激活劑 II的用途及生物活性檢測說明

G-switch?系列小G蛋白工具系列的開發側重于創建針對內源性Rho家族蛋白和信號通路的高效試劑。與依賴于過表達或敲降目標蛋白的方法（例如，DNA轉染顯性負性或?；钚訰ho突變體，RNAi敲降）相比，G-switch?試劑能夠迅速作用于內源性目標蛋白（根據產品而定，時間范圍為分鐘至小時），從而優化產生更具生理學相關性的反應的機會。G-switch?產品系列包括直接和間接調節Rho家族信號傳導的試劑，因此提供了廣泛的機制工具來研究這些關鍵的細胞功能。請訪問Cytoskeleton公司的網站獲取最新的G-switch?信息。

CN03的活性位點基于細菌細胞毒性壞死因子（CNF）毒素的催化結構域。催化結構域與一種專有的細胞穿透基團共價結合。CN03通過脫氨酰胺化位于這些GTP酶的Switch II區域的谷氨酰胺-63來激活Rho GTP酶亞型（1）。這種修飾將谷氨酰胺-63轉變為谷氨酸，從而阻斷了固有和GAP刺激的GTP酶活性，導致Rho的?；钚裕?）。在添加到培養基后的2-4小時內，CN03顯著增加了GTP結合的RhoA水平。此外，這種激活劑的有針對性作用使其比經典的間接激活劑（例如，LPA）更具吸引力，后者同時激活其他信號通路（例如，Ras、PI3K和PLC）。

艾美捷Rho 激活劑 II（#CN03）用途包括：

Rho通路激活劑

研究Rho活化對細胞運動的影響

研究Rho活化對肌動蛋白細胞骨架重排的影響

研究 Rho 激活對與其他信號轉導通路串擾的影響

材料：

CN03是在細菌表達系統中制備的。重組蛋白的分子量為118 kDa，并在其氨基端含有六個組氨酸殘基（His標簽）。經過固定金屬親和層析（圖1），已經純化至80%以上的純度。每個小瓶中提供的是白色凍干固體，含有20 ?g的CN03蛋白。該物質已經在RhoA激活的生物學檢測中顯示出活性（見下文）。在RhoA激活的生物學檢測中，一個包含單點突變的蛋白質失活突變體顯示出零活性（未顯示數據）。

儲存和重溶：

在常溫下運輸。凍干的蛋白質可以在4°C下干燥儲存6個月。CN03的凍干顆?？赡芸雌饋硭缮⑶逸p包裝，但這不會影響CN03的質量或性能。為了重溶，簡單離心以收集管底的產物，然后將每個小瓶中的產物重懸于200 ?l無菌水中，放在冰上靜置10分鐘，輕輕上下吸移混勻，得到0.1 ?g/?l的濃度。在使用之前，CN03應進一步與無血清培養基稀釋至0.25至5 ?g/ml的濃度（由用戶確定，參見圖2和表1）。通常，在3小時內，1 ?g/ml的濃度能夠在多種細胞類型中產生強大的RhoA激活。重溶的激活劑可以在液氮中快速冷凍，并在–70°C下儲存長達6個月。

Rho 激活劑 II生物活性檢測：

在37°C孵育2小時后，CN03（1 ?g/ml / 相當于10 ?l/ml）顯示出在瑞士3T3細胞中引發了十倍的RhoA激活（圖2和圖3）和應力纖維誘導（圖4）。在表1中詳細介紹了在幾種細胞類型中激活Rho的推薦條件。

活性檢測方法：瑞士3T3細胞激活

1. 在兩個含有10 ml DMEM / 10%胎牛血清（FBS）的10 cm?培養皿中，將瑞士3T3細胞以37°C / 5% CO2培養至30%的密度。

2. 將培養基更換為DMEM / 1% FBS，饑餓細胞24小時，然后轉移到DMEM / 0% FBS培養24小時。

3. 簡要離心CN03管，使其沉淀在管底。

4. 用200 ?l無菌水（0.1 ?g/?l）重溶CN03-請參見上面的儲存和重溶部分。

5. 用溫暖的DMEM將CN03稀釋至1 ?g/ml。

6. 吸去培養皿中的培養基，將含有CN03的培養基轉移到一個培養皿中。

7. 只向第二個培養皿中加入溫暖的DMEM。這是對照組，代表未刺激的細胞。

8. 在37°C和5% CO2下孵育2小時。通過G-LISA?分析（Cat. # BK124；圖2和圖3）或細胞形態學（Cat. # PHDG1；圖4）來檢測Rho活性。

Rho 激活劑 II文獻參考： 

1. Schmidt G., et al. 1997. Gln 63 of Rho is deamidated by Escherichia coli cytotoxic necrotizing factor-1. Nature. 387, 725-729.

2. Flatau G., et al. 1997. Toxin-induced activation of the G protein p21 Rho by deamidation of glutamine. Nature. 387, 729-733.

Cytoskeleton公司成立于1993年，專注于生物化學和細胞過程研究中的純化蛋白和便捷試劑盒開發與生產。公司提供藥物篩選、信號轉導、蛋白質轉錄后修飾（PTM）、細胞骨架研究相關的系列試劑盒和產品，尤其以細胞骨架相關研究見長，既能滿足于樣品較少的科學研究，也可以用于小規模篩選研究和高通量大規模篩選研究。此外，公司還提供微管蛋白，肌動蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等現有產品的藥物篩選服務。