Rho激活劑II：不可逆組成型激活，活細胞陽性對照優選

一、產品概述

CN03 是 G-Switch 系列產品中的核心成員，來源于細菌 CNF 毒素的催化結構域，并通過專有技術連接了細胞穿透性基團。該重組蛋白能夠快速、特異、不可逆地激活活細胞中的 RhoA、RhoB 和 RhoC 蛋白，為研究 Rho 介導的細胞事件提供了強大的正向調控工具。

CN03 在細菌表達系統中生產，為帶有 His 標簽的重組蛋白，分子量約為 118 kDa。每管提供 20 ug 凍干粉。該產品由Cytoskeleton研發，艾美捷代理。

二、核心應用場景

活細胞中 Rho 蛋白的直接激活：無需上游信號分子或激動劑，直接作用于 Rho 蛋白本身。

Rho 激活實驗的陽性對照：在進行 RNA 干擾、抑制劑篩選或基因敲除實驗時，作為驗證通路活性的可靠參照。

研究 Rho 介導事件的潛在機制：探究細胞骨架重塑、細胞遷移、黏附、增殖、分化等過程中 Rho 信號通路的上下游關系。

三、作用機制

CN03 通過催化 Switch II 區域第 63 位谷氨酰胺（Gln-63）的脫酰胺化，將其轉化為谷氨酸，從而阻斷 Rho GTPases 的內源性 GTP 水解活性。這一修飾導致 Rho 蛋白持續處于 GTP 結合狀態，實現組成型激活。與傳統的鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF）不同，CN03 不依賴于核苷酸交換，而是直接破壞 GTP 酶活性中心，因此激活效果為不可逆。

該機制對 RhoA、RhoB 和 RhoC 具有高度選擇性，對其他 Rho 家族成員（如 Rac 或 Cdc42）無明顯交叉激活作用。

四、產品關鍵特性匯總

特性 | 描述

分子量 | 118 kDa（含 His 標簽）

來源 | 細菌表達系統

純度 | >80%（考馬斯亮藍染色掃描密度法）

規格 | 20 ug/管，凍干粉

推薦工作濃度 | 1 ug/ml

激活時效 | 1–4 小時達到峰值

激活持續時間 | 不可逆，≥4 小時

典型激活倍數 | 10–15 倍

五、制備與使用方法

重構步驟

1. 每管凍干粉中加入 200 ul 無菌水。

2. 輕輕混勻至完全溶解，得到濃度為 0.1 mg/ml 的儲備液。

3. 根據實驗需要，用細胞培養基稀釋至工作濃度（推薦 1 ug/ml）。

用量計算

每管（20 ug）重構后可得 200 ul 儲備液（0.1 mg/ml）。

按 1 ug/ml 工作濃度計算，每管足夠配制 20 ml 工作液。

操作建議

將 CN03 直接加入細胞培養基中，無需轉染或顯微注射。

激活時間因細胞系而異，通常在 1–4 小時內達到最大激活水平。

由于激活不可逆，長時間實驗（≥4 小時）無需補加試劑。

純度分析

CN03 的純度通過 4–20% 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，經考馬斯亮藍染色，再使用掃描密度法進行評估。測定結果顯示純度 >80%。盡管并非絕對純品，但該純度已足以滿足絕大多數活細胞功能實驗的要求，且剩余組分不影響其生物活性。

生物活性測定

驗證方法

CN03 的生物活性通過其在活 Swiss 3T3 細胞中激活 RhoA 的能力進行驗證。使用 RhoA G-LISA 檢測試劑盒（BK124） 定量測定活化水平。

活性數據

以 1 ug/ml 處理細胞，1–2 小時內可產生約 10 倍的 RhoA 激活。

包含單點失活突變（催化結構域關鍵氨基酸替換）的突變蛋白在相同檢測中顯示零活性，證明 CN03 的激活作用完全依賴于其酶催化活性。

細胞系依賴性

不同細胞系對 CN03 的響應存在差異。建議在實驗前對特定細胞系進行時間梯度（1、2、4、6 小時）和濃度梯度（0.1、0.5、1、2 ug/ml）的預實驗，以確定最佳處理條件。

典型激活時間曲線

1 小時：可檢測到顯著激活（約 5–6 倍）

2 小時：達到約 10 倍激活

4 小時：達到峰值（10–15 倍），并維持至至少 4 小時

六、實驗注意事項

1. 不可逆性：CN03 激活的 Rho 無法通過洗滌或添加抑制劑逆轉，因此不適用于需要“關閉”信號的時間分辨實驗。

2. 細胞類型差異：原代細胞或某些懸浮細胞可能需要更高的濃度（最高 2 ug/ml）或更長的孵育時間（4–6 小時）。

3. 對照設置：建議同時設置未處理對照和熱滅活（95°C 10 分鐘）CN03 對照，以排除非特異性效應。

4. 儲存：凍干粉儲存于 -20°C，干燥避光。重構后建議在 4°C 下 1 周內使用，或分裝凍存于 -80°C（避免反復凍融）。