BPS Bioscience ADAR1 響應型熒光素酶報告基因 HEK293 細胞系：熒光素酶標記的基因調控平臺

ADAR1反應型熒光素酶報告基因HEK293細胞系是一種設計用來響應ADAR1酶活性的HEK293細胞系。這些細胞被改造以表達一個ADAR1報告基因構建體，包含一個ADAR1發夾靶標，其帶有可被ADAR1介導編輯成色氨酸（UUG）的終止密碼子（UAG），位于熒光素酶報告基因的上游（圖1）。

該細胞系已通過比較轉染ADAR1和ADAR2后的報告基因激活情況進行了驗證。這個細胞系已被用于開發恒定表達ADAR1的ADAR1活性熒光素酶報告基因HEK293細胞系（#82239）。

圖1：ADAR1反應型熒光素酶報告基因HEK293細胞系的作用機制圖示。

ADAR1報告基因構建體由一個帶有終止密碼子（UAG）的ADAR1發夾靶標組成，位于編碼熒光素酶的序列上游。在ADAR1活性存在的情況下，例如轉染ADAR1時，腺嘌呤被轉換成肌苷，現在編碼氨基酸色氨酸（UUG），使得熒光素酶的轉錄和表達成為可能。在沒有轉染ADAR1的情況下，熒光素酶不會被轉錄，細胞顯示背景熒光素酶活性。熒光素酶活性與ADAR1活性直接相關。

背景

ADAR（作用于RNA的腺苷脫氨酶）酶在RNA中執行腺苷到肌苷的堿基編輯，特別針對位于特定雙鏈莖環結構（圖1）中的腺苷。在健康的未感染細胞中，ADAR1對內源性雙鏈RNA進行A到I編輯，以防止其激活下游的dsRNA傳感器RIG-I（視黃酸誘導基因I）和MDA5（黑色素瘤分化相關蛋白5），進而激活促炎癥反應。ADAR1功能喪失突變導致dsRNA傳感器異常激活，并涉及自身免疫性疾病。ADAR1功能障礙也影響癌細胞生長、增殖和對免疫療法的反應。ADAR1在許多腫瘤類型中表達增加，ADAR1敲除已被證明可以改善對某些免疫療法的反應，如PD-1（程序性死亡蛋白1）/PD-L1（程序性死亡配體1）阻斷，并可繞過腫瘤免疫療法抵抗機制，使ADAR1成為治療開發的理想靶標。

HEK293細胞內源性ADAR1表達水平低，因此這個細胞系非常適合研究ADAR1的遺傳工程變體。例如，可以通過轉染或轉導將ADAR1變體引入細胞并比較其活性。使用熒光素酶作為報告基因允許簡單的檢測讀出，使這個細胞系成為ADAR1研究的有吸引力的細胞系統。

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應用

? 監測表達的ADAR1活性。

? 在細胞模型中比較ADAR1修飾和突變的活性，例如在研究ADAR1衍生物結構與功能關系以及RNA編輯療法的研究中。

細胞復蘇

1. 在37°C水浴中旋轉冷凍細胞瓶大約60秒。細胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶內的全部內容轉移到含有10毫升預熱的解凍培養基1的管中。

注意：在37°C水浴中放置細胞過久會導致細胞活力迅速下降。

2. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在5毫升預熱的解凍培養基1中重懸細胞。

3. 將重懸的細胞轉移到T25或T75培養瓶中，并在37°C、5% CO2培養箱中培養。

4. 培養24小時后，檢查細胞附著和活力。更換為新鮮的解凍培養基1，并繼續在37°C、5% CO2培養箱中培養，直到細胞準備好傳代。

5. 在細胞完全融合之前應進行傳代。在第一次傳代及后續傳代中，使用生長培養基1N。

細胞傳代

1. 吸去培養基，用不含Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基1N并轉移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在生長培養基1N中重懸細胞。

4. 按推薦的亞培養比例1:5至1:10每周一次或兩次播種到新的培養容器中。

細胞冷凍

1. 吸去培養基，用不含Ca2+/Mg2+的PBS洗滌細胞，并用0.05%胰蛋白酶/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基1N并計數細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在4°C細胞冷凍培養基（BPS Bioscience #79796）中重懸細胞，濃度約為1 x 10^6細胞/毫升。

4. 將1毫升細胞懸浮液分裝到每個冷凍管中。將管放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜儲存。

5. 次日將管轉移到液氮中進行長期儲存。

注意：建議在早期傳代擴展細胞并至少冷凍10管細胞以備將來使用。

驗證數據

? 以下實驗設計為96孔板格式。在不同的組織培養格式中進行實驗時，應適當調整細胞數量和試劑體積。

? 所有條件應在三個副本中進行。

? 實驗應包括“ADAR過表達”（通過轉染或其他方法引入ADAR1或ADAR2的細胞），“陰性對照”（未添加ADAR1或ADAR2，模擬轉染條件）和“背景發光”條件。

圖2：轉染不同ADAR1亞型的ADAR1反應型熒光素酶報告基因HEK293細胞系中ADAR1報告基因的反應。

細胞轉染編碼不同ADAR1亞型（ADAR1 p150和ADAR1 p110）或ADAR2的質粒24小時。使用One-Step?熒光素酶檢測系統測量熒光素酶活性。結果表示為ADAR1熒光素酶報告基因活性的倍數誘導（與未過表達ADAR的細胞相比）。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認證的生命科學領域的供應商，公司一直致力于開發藥物研發領域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創立，從創立至今一直致力于提供藥物研發領域的創新解決方案，以推動新的藥物發現。公司主要關注的領域包括免疫療法、表觀遺傳學、新型冠狀病毒、CRISPR、細胞信號轉導等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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