BPS Bioscience NFAT 報告基因 - HEK293 細胞系 (PKC/Ca2+ 通路)，NFAT信號傳導監測

蛋白激酶C (PKC)/鈣離子(Ca2+)響應途徑會導致激活T細胞激活因子的核因子（NFAT）。NFAT由Ca2+和鈣離子/鈣調蛋白依賴的絲氨酸磷酸酶鈣調磷酸酶調控。在靜息細胞中，NFAT蛋白被磷酸化并位于細胞質中；受到刺激后，它們會被鈣調磷酸酶去磷酸化，轉移到細胞核，并誘導基因表達。

NFAT報告基因-HEK293細胞系包含一個在NFAT響應元件控制下的螢火蟲熒光素酶基因，該基因被穩定整合到HEK293細胞中。這個細胞系已經驗證了對佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和伊諾莫辛的刺激反應。

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應用

? 監測細胞內鈣離子水平。

? 篩選PKC/Ca2+途徑的激活劑或抑制劑。

所需但未提供的材料

? PMA（LC Laboratories, #P1680）在DMSO中制備庫存溶液。

? 伊諾莫辛（Sigma, #I3909）在DMSO中制備庫存溶液。

? 檢測培養基：解凍培養基1（無遺傳霉素）

? 生長培養基1B（BPS Cat. #79531）

? 96孔組織培養板或96孔組織培養處理的白色透明底部檢測板

? RO-31-8220（EMD Millipore, #557520）或其他PKC抑制劑

? 用于測量螢火蟲熒光素酶活性的ONE-Step熒光素酶檢測試劑（BPS Bioscience, #60690）。

? 熒光素酶檢測儀

A. NFAT報告基因-HEK293細胞對TCR交聯劑的反應。

1. 在生長培養基1B中收獲NFAT報告基因-HEK293細胞，并將細胞以每孔約30,000個細胞的密度播種到含有45 ?l檢測培養基的白色透明底部96孔微孔板中。

2. 將板在37°C的CO2培養箱中培養過夜（約18-24小時）。

3. 將TCR交聯劑（PMA與伊諾莫辛）稀釋到檢測培養基中，達到所需最終濃度的10倍，并每孔加入5 ?l稀釋液。（我們建議從30 nM PMA和1 ?M伊諾莫辛的起始濃度開始。）最終DMSO濃度可高達0.5%。

向未刺激對照孔中加入相同濃度DMSO但不含交聯劑的5 ?l檢測培養基。

向無細胞對照孔中加入含DMSO的50 ?l檢測培養基（用于確定背景發光）。

每個處理至少設置三次重復。

4. 將細胞在37°C的CO2培養箱中培養過夜（約18小時）。

5. 第二天，使用ONE-Step熒光素酶檢測系統進行熒光素酶檢測：

每孔加入50 ?l ONE-Step熒光素酶試劑，并在室溫下搖動約15分鐘。使用熒光素酶檢測儀測量發光。

6. 數據分析：從所有孔的發光讀數中減去平均背景發光（無細胞對照孔）。

NFAT熒光素酶報告基因表達的誘導倍數 = 刺激孔的背景減去發光/未刺激對照孔的平均背景減去發光。

圖1. NFAT報告基因（熒光素酶）-HEK293細胞對TCR交聯劑伊諾莫辛與PMA的反應。

B. NFAT報告基因-HEK293細胞對TCR交聯劑抑制劑的反應。

1. 在生長培養基1B中收獲NFAT報告基因-HEK293細胞，并將細胞以每孔約30,000個細胞的密度播種到含有45 ?l檢測培養基的白色透明底部96孔微孔板中。

2. 將板在37°C的CO2培養箱中培養過夜（約18-24小時）。

3. 將抑制劑（RO-31-8220）稀釋到檢測培養基中，達到所需最終濃度的10倍，并每孔加入5 ?l稀釋液。最終DMSO濃度可高達0.5%。

向未抑制對照孔中加入相同濃度DMSO但不含抑制劑的5 ?l檢測培養基。

4. 將TCR交聯劑（PMA與伊諾莫辛）稀釋到檢測培養基中，達到所需最終濃度的10倍（我們建議從30 nM PMA和1 ?M伊諾莫辛的起始濃度開始）并每孔加入5 ?l稀釋液。最終DMSO濃度可高達0.5%。

向未刺激對照孔中加入相同濃度DMSO但不含交聯劑的5 ?l檢測培養基。

向無細胞對照孔中加入含DMSO的55 ?l檢測培養基（用于確定背景發光）。

每個處理至少設置三次重復。

5. 將細胞在37°C的CO2培養箱中培養過夜（約18小時）。

第二天，使用ONE-Step熒光素酶檢測系統進行熒光素酶檢測：

每孔加入55 ?l One-Step熒光素酶試劑，并在室溫下搖動約15分鐘。使用熒光素酶檢測儀測量發光。

6. 數據分析：從所有孔的發光讀數中減去平均背景發光（無細胞對照孔）。

通過將每種條件除以刺激孔的背景減去發光來計算NFAT熒光素酶報告基因表達的百分比。在沒有RO-31-8220的情況下，用1 ?M伊諾莫辛和30 nM PMA刺激的細胞的背景減去發光被設為100%。

圖2. RO-31-8220抑制PKC在PMA和伊諾莫辛誘導的NFAT報告基因（熒光素酶）-HEK293細胞中的作用。

結果以發光百分比顯示。在沒有RO31-8220的情況下，用1 ?M伊諾莫辛和30 nM PMA刺激的細胞的背景減去發光被設為100%。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認證的生命科學領域的供應商，公司一直致力于開發藥物研發領域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創立，從創立至今一直致力于提供藥物研發領域的創新解決方案，以推動新的藥物發現。公司主要關注的領域包括免疫療法、表觀遺傳學、新型冠狀病毒、CRISPR、細胞信號轉導等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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