BPS Bioscience CGRPR/CRE 熒光素酶報告基因 HEK293 細胞系，CGRP信號傳導研究平臺

重組HEK293細胞系穩定表達全長人類降鈣素受體樣受體（CALCRL/CRLR/CLR；登錄號：NM_005795）和由多聚化的cAMP反應元件（CRE）控制的螢火蟲熒光素酶。這一細胞系可用于通過熒光素酶報告基因活性作為讀出，測量CGRP受體激動劑和拮抗劑的EC50和IC50。

背景

降鈣素基因相關肽（CGRP）受體是一種由三個組分構成的G蛋白偶聯受體：降鈣素受體樣受體（CALCRL）、受體活性調節蛋白（RAMP1）和CGRP受體組分蛋白（CRCP）。RAMP1對于降鈣素樣受體向質膜的轉運和與CGRP激動劑的偶聯是必需的。CRCP參與CGRP受體與G蛋白之間的關聯。在配體結合后，復合物與G蛋白相互作用，Gαs亞基從復合物中解離并激活腺苷酸環化酶，產生cAMP。細胞內cAMP濃度的升高刺激cAMP依賴的信號通路，最終導致轉錄因子cAMP反應元件結合蛋白（CREB）結合到CRE啟動子并誘導基因表達。

圖1：CGRP的作用機制。

臨床前證據表明，在偏頭痛期間，三叉神經節中激活的感覺神經元在其位于腦膜內的投射神經末梢釋放CGRP。釋放的CGRP隨后結合并激活CGRP受體，引起血管擴張和血漿外滲。進一步的證據來自觀察到靜脈注射α-CGRP會在易感個體中引起頭痛。最近在理解CGRP在偏頭痛中的作用方面取得的突破，促進了一類新的CGRP拮抗劑生物制劑的開發，這些生物制劑有望比傳統藥物治療有顯著改善。

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應用

? 在免疫療法研究和藥物發現中篩選CGRP受體的激活劑或抑制劑。

? 篩選抗CGRP抗體。

細胞培養協議

注意：HEK293細胞源自人類材料，因此建議采取適當的安全預防措施。

細胞解凍

1. 從液氮儲存中取出一個細胞小瓶。在準備解凍前保持在干冰上。

2. 準備解凍時，在37°C水浴中搖晃裝有冷凍細胞的小瓶大約60秒。一旦細胞解凍（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將小瓶的全部內容轉移到一個空的50毫升錐形管中。

注意：在37°C的水浴中放置細胞過久會導致活性迅速喪失。

3. 使用10毫升的血清學移液管，緩慢地向含有細胞的錐形管中加入10毫升預溫的解凍培養基1。解凍培養基1應滴加同時輕輕搖晃錐形管，以實現溫和混合并避免滲透沖擊。

4. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基并用5毫升預溫的解凍培養基1重懸細胞。

5. 將重懸的細胞轉移到T25或T75培養瓶中，并在37°C和5% CO2培養箱中培養。

6. 培養24小時后，檢查細胞附著和活性。更換培養基為新鮮的解凍培養基1，并繼續在37°C和5% CO2培養箱中培養，直到細胞準備好分裂。

7. 細胞應在完全融合前進行傳代。在第一次傳代和后續傳代中，使用生長培養基1G。

細胞傳代

1. 抽吸培養基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05%胰酶/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基1G并轉移到試管中。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基并用生長培養基1G重懸細胞。

4. 按照推薦的1:10至1:20的傳代比例，每周或每兩周將細胞種植到新的培養容器中。

細胞冷凍

1. 抽吸培養基，用無Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細胞，并用0.05%胰酶/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基1G并計數細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基并在4°C的細胞冷凍培養基（BPS Bioscience #79796）中重懸細胞，細胞濃度約為2 x 10^6個細胞/毫升。

4. 將1毫升的細胞懸浮液分裝到每個冷凍小瓶中。將小瓶放入保溫容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

5. 次日將小瓶轉移到液氮中長期保存。

注意：建議在早期傳代時擴增細胞并至少冷凍10個小瓶以備將來使用。

圖2：CGRPR/CRE熒光素酶報告基因HEK293細胞系中人類CALCRL的細胞表面表達。

CGRPR/CRE熒光素酶報告基因HEK293細胞或CRE熒光素酶報告基因HEK293親本細胞用一級抗CALCRL抗體（Aviva #APR42260）和PE標記的驢抗兔二級抗體（Biolegend #406421）染色，并通過流式細胞儀分析。Y軸代表細胞數量百分比。X軸表示PE的強度。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認證的生命科學領域的供應商，公司一直致力于開發藥物研發領域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創立，從創立至今一直致力于提供藥物研發領域的創新解決方案，以推動新的藥物發現。公司主要關注的領域包括免疫療法、表觀遺傳學、新型冠狀病毒、CRISPR、細胞信號轉導等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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