BPS Bioscience CRISPRa (SAM) HEK293 細胞系--快速生成CRISPR激活的HEK293細胞池或細胞系

這一細胞系已被工程化，用于CRISPR協同激活介質（SAM）系統，以誘導任何感興趣基因的轉錄激活和表達。細胞穩定表達一種突變的dCas9（化膿性鏈球菌CRISPR相關蛋白9），缺乏任何內切核酸酶活性，與轉錄激活因子VP64融合。穩定的dCas9-VP64表達通過Blasticidin抗性維持。細胞還穩定表達與MS2標簽融合的P65（轉錄因子p65，或核因子NF-κB p65）和HSF1（熱休克因子1），通過Hygromycin抗性維持。當這些細胞被轉染以MS2標簽的sgRNA，靶向感興趣基因的啟動子區域時，dCas9-VP64和MS2-P65-HSF1被招募到基因組DNA并開始轉錄，誘導所需基因的表達。

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應用

1. 快速生成CRISPR激活的HEK293細胞池或細胞系

2. 在HEK293細胞中實施sgRNA CRISPRa篩選

推薦培養條件

1. 建議在37?C水浴中快速解凍液氮中的冷凍細胞，然后將小瓶的全部內容轉移到含有10毫升解凍培養基6（不含Hygromycin或Blasticidin）的試管中。

2. 然后離心細胞，去除上清液，并用5毫升預溫的解凍培養基6（不含Hygromycin或Blasticidin）重懸細胞。

3. 將重懸的細胞轉移到T25培養瓶中，并在37?C和5% CO2培養箱中培養。

4. 培養24小時后，再加入額外的3-4毫升解凍培養基6（不含Hygromycin或Blasticidin）。

5. 在第一次傳代時，切換到含有Hygromycin和Blasticidin的生長培養基6D。

傳代：

1. 當細胞達到90%融合時，去除生長培養基，并用不含鎂或鈣的PBS沖洗兩次。

2. 向細胞中加入2-3毫升0.25%胰酶/EDTA，并在37°C下培養2-3分鐘。

3. 通過光學顯微鏡確認細胞脫落后，加入10毫升預溫的生長培養基6D，并輕輕上下吹打以分散細胞團。

4. 將細胞轉移到15毫升錐形管中，并以200 x g的速度離心5分鐘。

5. 去除培養基，并用10毫升預溫的生長培養基6D重懸細胞。

6. 將2毫升細胞懸浮液分裝到新的T75培養瓶中，其中含有預溫的18毫升生長培養基6D（推薦傳代比例為1:2至1:10）。

7. 在濕度控制的37°C培養箱中，含有5% CO2的條件下培養細胞。

冷凍保存：

1. 當細胞達到90%融合時，如上所述使用胰酶從培養板中移除細胞，離心細胞并從沉淀中去除培養基。

2. 在含有10% DMSO的FBS中的冷凍培養基中重懸細胞。

3. 使用減速冷凍盒（每分鐘下降-0.5°C至-1°C）將細胞冷凍至-80°C，然后將細胞轉移到液氮中長期保存。

已證明細胞至少穩定15代；BPS建議準備冷凍庫存，以便細胞使用不超過20代。

圖1. CRISPRa（SAM）HEK293細胞中PD-1的誘導。

CRISPRa（SAM）HEK293細胞被sgRNA-MS2慢病毒轉導，靶向PD-1（BPS Bioscience，#78190）以誘導PD-1表達。在電穿孔后72小時（無選擇）用PE標記的抗PD-1抗體（BioLegend，#637309）染色，并用流式細胞儀分析。親本CRISPRa（SAM）HEK293細胞以藍色顯示，轉染的CRISPRa（SAM）HEK293細胞以綠色顯示。

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認證的生命科學領域的供應商，公司一直致力于開發藥物研發領域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創立，從創立至今一直致力于提供藥物研發領域的創新解決方案，以推動新的藥物發現。公司主要關注的領域包括免疫療法、表觀遺傳學、新型冠狀病毒、CRISPR、細胞信號轉導等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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