BPS Bioscience Notch1/CSL 熒光素酶報告基因 HEK293 細胞系，發育生物學與癌癥研究

Notch1/CSL熒光素酶報告基因HEK293細胞系是一種HEK293細胞系，表達由Notch反應元件（CSL反應元件）控制的螢火蟲熒光素酶報告基因，以及表達Notch1ΔE（整個細胞外結構域被刪除的Notch1）。在細胞內，Notch1ΔE可以被γ-分泌酶切割。這種活躍的Notch1 NICD（Notch細胞內結構域）轉移到細胞核并誘導熒光素酶報告基因的表達。該細胞系已通過使用已知的Notch信號通路抑制劑來驗證熒光素酶報告基因表達的抑制。

背景：

Notch信號通路控制脊椎動物和無脊椎動物組織中的細胞命運決定，并參與胚胎發育、組織穩態以及免疫和血管生成系統的調節。Notch信號通過與存在于相對細胞中的跨膜配體結合到四個現有的Notch跨膜受體之一（Notch1/Notch2/Notch3/Notch4）來觸發。這導致Notch受體的蛋白水解切割，釋放Notch受體的恒定活躍的細胞內結構域（NICD）。NICD轉移到細胞核，并與轉錄因子CSL（CBF1/RBPJκ/無毛抑制因子/Lag-1）和共激活因子Mastermind結合，啟動Notch反應基因的轉錄。Notch信號的功能障礙有嚴重后果，包括發育病理或癌癥（如T細胞急性淋巴細胞性白血病、T-ALL和尿路上皮膀胱癌）。作為癌癥治療選項以及在組織再生中使用Notch抑制劑，主要是γ-分泌酶抑制劑，正在進行中。進一步的研究將使我們更深入地理解Notch信號，并有利于未來的治療途徑。

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應用：

- 監測Notch信號通路活性。

- 在細胞模型中篩選Notch信號通路的抑制劑。

細胞培養協議：

細胞解凍：

1. 從液氮存儲中取出一個細胞瓶。在準備好解凍之前，將其保存在干冰上。

2. 準備好解凍時，在37°C水浴中旋轉冷凍細胞瓶大約60秒。一旦細胞解凍（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶中的全部內容轉移到一個空的50毫升錐形管中。

注意：在37°C水浴中放置細胞太久會導致活性迅速喪失。

3. 使用10毫升的血清學移液管，慢慢地向含有細胞的錐形管中加入10毫升預熱的解凍培養基1。解凍培養基1應該滴加，同時輕輕搖晃錐形管，以實現溫和混合，避免滲透沖擊。

4. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在5毫升預熱的解凍培養基1中重懸細胞。

5. 將重懸的細胞轉移到T25或T75培養瓶中，并在37°C、5% CO2培養箱中培養。

6. 培養24小時后，檢查細胞附著和活力。更換為新鮮的解凍培養基1，并在37°C、5% CO2培養箱中繼續培養，直到細胞準備好分裂。

7. 細胞應在完全融合前分裂。在第一次傳代及后續傳代中，使用生長培養基1A。

細胞傳代：

1. 抽吸培養基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并用0.05% Trypsin/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基1A并轉移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在生長培養基1A中重懸細胞。

4. 按照推薦的次培養比例1:10每周一次或兩次將細胞種植到新的培養容器中。

細胞冷凍：

1. 抽吸培養基，用無Ca2+/Mg2+的PBS沖洗細胞，并用0.05% Trypsin/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基1A并計數細胞。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在4°C細胞冷凍培養基（BPS Bioscience #79796）中重懸細胞，細胞濃度約為2 x 10^6細胞/ml。

4. 將1毫升的細胞懸浮液分裝到每個冷凍瓶中。將瓶子放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

5. 次日將瓶子轉移到液氮中進行長期存儲。

注意：建議擴展細胞并在早期傳代時至少冷凍10瓶細胞以備將來使用。

圖1：Notch1/CSL熒光素酶報告基因HEK293細胞系對DAPT（一種Notch通路抑制劑）的響應。

DAPT抑制Notch1/CSL熒光素酶報告基因HEK293細胞中熒光素酶的表達。CSL報告基因HEK293細胞用作對照。CSL報告基因HEK293細胞系包含由Notch反應元件（CSL反應元件）控制的螢火蟲熒光素酶報告基因，但不表達Notch1ΔE，因此無法表達Notch熒光素酶報告基因。活性使用ONE-Step?熒光素酶檢測系統進行測量。

文獻參考：

1. Lu F.M., et al., 1996 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(11): 5663-5667.

2. Kanungo J., et al., 2008 J. Neurochem. 106: 2236-48.

3. Cao L. et al., 2023 Blood Adv. 10.1182/bloodadvances.2023010380

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認證的生命科學領域的供應商，公司一直致力于開發藥物研發領域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創立，從創立至今一直致力于提供藥物研發領域的創新解決方案，以推動新的藥物發現。公司主要關注的領域包括免疫療法、表觀遺傳學、新型冠狀病毒、CRISPR、細胞信號轉導等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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