BPS Bioscience RARα 熒光素酶報告基因 HEK293 細胞系，藥物篩選與核受體活性監測

RARα熒光素酶報告基因HEK293細胞系是經過工程改造的HEK293細胞，表達受視黃酸反應元件（RARE）控制的條件性螢火蟲熒光素酶報告基因，并持續表達全長人類視黃酸受體α（RARα, NM_0.00964）。該細胞系已功能驗證，能響應全反式視黃酸（ATRA）刺激。

圖1：RARα/RARα熒光素酶報告基因HEK293細胞系中視黃酸依賴性熒光素酶報告基因的激活。

背景：

視黃酸受體（RAR）屬于核受體家族，有三種亞型：RARα、RARβ和RARγ。RAR與視黃酸X受體（RXR）異二聚化，并作為轉錄因子調節正常和惡性細胞的生長和分化。當RAR與其配體結合，全反式視黃酸（ATRA）或9-順式視黃酸時，RAR/RXR異二聚體結合到目標基因啟動子區域的視黃酸反應元件。這會招募共激活蛋白，導致下游目標基因的轉錄和表達。視黃酸（維生素A的衍生物）信號在胚胎和免疫系統發育中扮演關鍵角色。RARα的突變可能導致急性早幼粒細胞性白血?。ˋPL），其特征是血液中的前體細胞（早幼粒細胞）積累，以及其他類型的癌癥。視黃酸的使用可能在癌癥治療中證明是有益的。

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應用：

- 監測RARα調控的信號通路活性。

- 篩選RARα的激動劑和拮抗劑。

細胞解凍：

1. 在37°C水浴中旋轉冷凍細胞瓶大約60秒。細胞解凍后（可能比60秒稍快或稍慢），迅速將瓶中的內容轉移到含有10毫升預熱的解凍培養基6的管中。在37°C水浴中放置細胞太久會導致活性迅速喪失。

2. 立即以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在5毫升預熱的解凍培養基6中重懸細胞。

3. 將重懸的細胞轉移到T25培養瓶中，并在37°C、5% CO2培養箱中培養。

4. 培養48-72小時后，檢查細胞活力，更換為新鮮的解凍培養基6，并在37°C、5% CO2培養箱中繼續培養，直到細胞準備好傳代。

5. 細胞應在達到100%融合前傳代。傳代時切換到生長培養基6A。

細胞傳代：

1. 抽吸培養基，用無Ca2+/Mg2+的磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細胞，并按照所用培養容器推薦的體積用0.25% Trypsin/EDTA從培養容器中分離細胞。

2. 一旦細胞分離，加入生長培養基6A并轉移到管中。

3. 以300 x g的速度離心細胞5分鐘，去除培養基，并在生長培養基6A中重懸細胞。

4. 按照推薦的次培養比例1:10至1:20每周兩次將細胞種植到新的培養容器中。

細胞冷凍：

1. 分離后，以300 x g的速度離心細胞5分鐘。

2. 去除培養基，并在4°C細胞冷凍培養基（BPS Bioscience #79796）中重懸細胞，密度約為2 x 10^6細胞/ml。

3. 將1毫升的細胞懸浮液分裝到每個冷凍瓶中。將瓶子放入絕緣容器中緩慢冷卻，并在-80°C下過夜保存。

4. 次日將瓶子轉移到液氮中進行長期存儲。

注意：建議擴展細胞并在早期傳代時至少冷凍10瓶細胞以備將來使用。

檢測培養基：

檢測培養基6A。

1. 在種植細胞前24小時，去除生長培養基6A并替換為檢測培養基。

2. 將細胞分散并種植約30,000細胞/孔在90 ?l的檢測培養基中于96孔白色透明底板中。

3. 在“細胞自由對照”孔中加入90 ?l的檢測培養基（用于確定背景發光）。

4. 準備ATRA（每孔10 ?l）：首先在100% DMSO中準備ATRA的庫存溶液，濃度為期望最高濃度的2000倍。最終體積為100 ?l。

   在檢測培養基中稀釋200倍，準備含0.5% DMSO的中間10倍庫存溶液。

   在0.5% DMSO的檢測培養基中準備ATRA的連續稀釋液，濃度比期望的最終濃度高10倍。準備含0.5% DMSO的檢測培養基（稀釋液）用于對照（稀釋液）。

   注意：檢測中DMSO的最終濃度不應超過0.1%。

5. 向每個孔中加入10 ?l稀釋的ATRA。

6. 向“未刺激對照”孔和“細胞自由對照”孔（背景）中加入10 ?l稀釋液。

7. 在37°C、CO2培養箱中培養細胞約16至24小時。

8. 每孔加入100 ?l的ONE-Step?熒光素酶試劑，并在室溫下輕輕搖動約15分鐘。

9. 使用發光儀測量發光。

10. 從所有孔的發光讀數中減去平均背景發光（無細胞對照孔）。通過將ATRA刺激的發光與未刺激對照發光相除，可以計算RARα熒光素酶報告基因表達的倍數誘導。

文獻參考：

Petkovich M., et al., 1987 Nature. 330 (6147):440-50.

Allenby J., et al., 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 (1):30-4.

Peng Z., et al., 2023 J Immunotherapy Cancer 11 (3): e006325.

BPS Bioscience是一家通過ISO 9001:2015認證的生命科學領域的供應商，公司一直致力于開發藥物研發領域的重組蛋白酶、蛋白酶活性/抑制劑篩選試劑盒和慢病毒等工具。公司由Henry Zhu博士于2005年創立，從創立至今一直致力于提供藥物研發領域的創新解決方案，以推動新的藥物發現。公司主要關注的領域包括免疫療法、表觀遺傳學、新型冠狀病毒、CRISPR、細胞信號轉導等，主要提供激酶、磷酸二酯酶、磷酸酶、組蛋白去甲基化酶、組蛋白甲基化轉移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶等。 

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