Cardiolipin瓊脂糖珠--脂質珠蛋白質下拉實驗說明

脂質珠是為蛋白質下拉實驗而設計的。可能的用途是在純化蛋白溶液、細胞裂解物中測試脂質結合，或測試放射性標記的體外翻譯產物的結合。

心磷脂珠由瓊脂糖組成，每1ml珠含有10納摩爾結合的心磷脂，足以進行多次蛋白質結合實驗。

細胞裂解物/蛋白質的制備（過程可能因細胞類型/來源而異）：

這是使用細胞裂解物時的通用方法。應避免苛刻的裂解條件，因為它們可能會干擾脂質結構和結合。非離子清潔劑，如Igepal、NP40和Triton X-100，比離子清潔劑不那么苛刻，不變性，用于溶解和純化膜蛋白復合物。

1、分離并離心細胞。

2、溶解顆粒。

3、渦旋和離心以制備澄清樣品。

艾美捷Cardiolipin瓊脂糖珠（BGT-OPU-101）裂解緩沖液：

鹽（10-20 mM HEPES，pH 7.4，100-150 mM NaCl）

非離子洗滌劑*（如0.1–2%Igepal）

二價陽離子（0-10 mM EDTA和/或EGTA）

蛋白酶抑制劑（完整的迷你蛋白酶片、原釩酸鈉、氟化鈉）

脂質珠?檢測說明：

1. 脂質包被珠有1 mL和0.1 mL兩種規格，以50%的漿液形式在1X PBS緩沖液中提供。

2. 訂購1 mL脂質珠，附帶200 ?L的對照珠。對照珠也可單獨購買，建議用于分析。

3. 儲存于2-8°C。產品對溫度和光線敏感，請勿冷凍。

4. 以1,000 x g或更低速度離心珠。不要高速離心珠，因為這可能會壓碎珠。

5. 每1 mL珠中總共有10納摩爾的結合脂質。

6. 珠的直徑范圍在45至165微米之間。

7. 每個蛋白使用50-100 ?L的50%漿液脂質包被珠和對照珠。

脂質珠? - 蛋白拉下協議：

1. 充分混合珠（不要渦旋）。將50-100 ?L的50%珠漿液轉移到0.5-1.5 mL的管中。

2. 以1,000 x g或更低速度離心珠以沉淀。小心移除上清液，避免丟失珠。

3. 用洗滌緩沖液的10倍過量洗滌珠。輕輕混合，孵育1-2分鐘。重復洗滌步驟兩次。

4. 小心移除洗滌上清液，并將珠在含有您的蛋白的結合緩沖液中重新懸浮。

a. 對于純化的蛋白，使用1-10微克的蛋白，稀釋在足夠的結合緩沖液中形成50%脂質珠漿液。

b. 對于細胞裂解物、提取物、亞細胞分數：使用大約1毫克的總蛋白對1 mL結合緩沖液。將整個1 mL準備好的樣品加入您洗滌過的珠中。

5. 孵育蛋白-珠溶液1-3小時。孵育可以在室溫或4°C下進行，取決于您蛋白的穩定性。需要連續運動以保持珠懸浮。

6. 沉淀珠并小心移除上清液。如果需要，上清液可以用來監測未結合的蛋白。

7. 用洗滌緩沖液的10倍過量洗滌珠。輕輕混合，孵育1-2分鐘。重復洗滌步驟五次。如果您選擇在結合緩沖液中使用牛血清白蛋白（BSA），請確保在進入下一步之前將其徹底洗出。

8. 在最后一次洗滌后，通過向珠中加入等體積的2X Laemmli樣品緩沖液（或類似物）并加熱至70°C 10分鐘來洗脫結合的蛋白。

9. 加熱后，沉淀珠并移除上清液。將上清液儲存在4°C下，直到分析。丟棄珠。

10. 蛋白可以通過SDS-PAGE分離，并通過凝膠的Coomassie藍染色、蛋白轉移和免疫印跡來檢測感興趣的蛋白，或進行自顯影。