AT 655 琥珀酰亞胺酯/AT 655 NHS Ester

琥珀酰亞胺酯（SE，也稱為 NHS 酯）與伯胺反應，例如蛋白質中的賴氨酸殘基。 琥珀酰亞胺酯標記通常用于結合蛋白質和抗體。 該反應需要目標蛋白上的胺基去質子化并與 SE 反應的堿性 pH，通常在 pH 8.3 的碳酸氫鹽緩沖液中進行。 琥珀酰亞胺酯染料具有在水存在下隨時間水解的缺點。 多磺化染料，例如 Alexa Fluor? 染料、DyLight? 染料和 IRDye? 尤其具有吸濕性，會加劇水解問題。

艾美捷AT 655 琥珀酰亞胺酯：

Cat#：B-CHM502/B-CHM503/B-CHM504/B-CHM505

規格：1 mg

儲存：在-20°C下儲存，避光

形態：結晶固體

光譜特性：見上文

儲存條件：儲存溫度為-20°C，避光。

穩定性：在適當的儲存條件下穩定至少12個月。

用AT NHS標記蛋白質的建議方案：

AT NHS酯很容易與蛋白質的氨基反應。NHS酯結合的合適pH范圍是pH

8.0-9.0。在這個pH范圍內，蛋白質的氨基，特別是賴氨酸的氨基，被充分去質子化以進行快速偶聯。

AT 655 琥珀酰亞胺酯所需材料：

1、溶液A:PBS緩沖液（磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4）：將8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na2HPO4-2H2O和0.24 g KH2PO4溶解在1L蒸餾水中。

2、溶液B:0.2 M碳酸氫鈉溶液，用2 M氫氧化鈉將pH調節至9.0。

3、溶液C：將20份溶液A和1份溶液B混合，得到pH為8.3的標記緩沖液。將該溶液儲存在密封瓶中，以保持長期穩定性。

4、溶液D：將1.0 mg NHS酯溶解在50-200 ul無水、不含胺的二甲基亞砜（DMSO）或乙腈中。

蛋白質結合物的儲存

通常，綴合物的儲存條件應與未修飾蛋白質的儲存條件相同。當溶液在4℃下儲存時，建議添加疊氮化鈉作為防腐劑（最終濃度為2mM）。在將綴合物添加到活細胞標本中的應用中，可能需要在使用前去除防腐劑以避免抑制作用。綴合物應在4C下穩定數月。對于長期儲存，溶液可以分成等分試樣，并在-20°C下冷凍。避免重復冷凍和解凍。染料偶聯物應盡可能存放在避光的地方。

確定平均標記度（DOL）

平均標記度（DOL）表示染料分子與蛋白質分子的比例，可以通過吸收光譜法使用朗伯-比爾定律來確定：吸光度（A）=消光系數（e）×摩爾濃度x路徑長度（d）。在石英（紫外透明）比色皿中凝膠過濾后，只需測量共軛溶液的紫外-可見光譜。如果溶液濃度過高，無法準確測量吸光度，則可能需要稀釋溶液。在染料的最大吸收波長（abs）和280nm（A280）（蛋白質的最大吸收率）下測量吸光度（Ama）。染料濃度的計算公式為：c（染料）=Ama/Emx x d，其中Ema是染料在最大吸收波長下的消光系數。類似地，基于280 nm處的吸光度，使用公式確定蛋白質濃度：c（蛋白質）=Apot/Eprot x d，其中Eprot是280 nm處蛋白質的消光系數。由于所有染料在280nm處都具有一定的吸光度，因此必須根據染料的貢獻來校正在A280處測量的吸光度。蛋白質濃度可計算為：Aprot=A28o-Amax×CF?8o，然后c（蛋白質）=Anot/Eprotxd。標記程度，代表與蛋白質分子結合的染料分子的平均數量，可以基于

關于上述關系。

僅供研究使用，不用于人類或臨床診斷

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